在21世紀(jì)之交，冠狀病毒是病毒學(xué)中最晦澀難懂的課題之一——人們很難對只會引起輕微鼻塞的病原體產(chǎn)生太多興趣。盡管為資金苦苦掙扎，但還是有一些科學(xué)家對這些RNA病毒進行了大量的基礎(chǔ)研究。然后，在2002年，成群的患者突然出現(xiàn)了。一種新型的嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS），與一種從動物傳染給人類的新型冠狀病毒聯(lián)系起來。幾千例病例和數(shù)百例死亡之后，公共衛(wèi)生官員控制住了SARS的傳播，但冠狀病毒學(xué)領(lǐng)域卻被徹底改變了。
在SARS危機之后，野生動物調(diào)查和監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，自然界中有許多冠狀病毒，理論上在適當(dāng)?shù)那闆r下，可能會傳染給人類。到2019年，這些發(fā)現(xiàn)以及由人畜共患病冠狀病毒感染引起的另一種嚴(yán)重呼吸道疾病——中東呼吸綜合征（MERS）的出現(xiàn)清楚表明，冠狀病毒對全球健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。然后，2020年新冠病毒出現(xiàn)，全球新冠肺炎疫情大流行開始。隨著這場危機的規(guī)模變得清晰，全球科學(xué)家和制藥公司開始聯(lián)合起來應(yīng)對它，通常會重新利用為對抗其他疾病而開發(fā)的技術(shù)。2020年是每個人都成為冠狀病毒學(xué)家的一年。
打通LAMP技術(shù)
對于疫苗開發(fā)人員來說，前方的道路既明顯又艱難。甚至在世界衛(wèi)生組織宣布新冠肺炎疫情全球大流行之前，數(shù)百名學(xué)術(shù)和企業(yè)科學(xué)家就已經(jīng)將現(xiàn)有的工具和技術(shù)用于開發(fā)新冠病毒疫苗。然而，隨著這項努力的推進，公共衛(wèi)生官員迫切需要可用的診斷測試方法。由于許多新冠病毒感染是無癥狀或輕型的，跟蹤病毒的傳播需要快速、可靠的檢測，而現(xiàn)有的資源無法勝任這一任務(wù)。幸運的是，援軍已經(jīng)在路上。
“在危機之前，我們從來沒有研究過冠狀病毒。”法國蒙彼利埃國家科學(xué)研究中心Sys2Diag項目主任Franck Molina坦言。然而，Molina的團隊處于開發(fā)新一代新冠病毒測試方法的理想位置——實驗室的學(xué)術(shù)—企業(yè)協(xié)作使團隊具有多學(xué)科優(yōu)勢，包括從實驗室研究人員到人工智能和生物信息學(xué)工程師的一切。Sys2Diag此前開發(fā)了用于定制癌癥治療的液體活檢測試，現(xiàn)在轉(zhuǎn)向測量病毒RNA，而非腫瘤生物標(biāo)記物。
當(dāng)該團隊的研究人員開始開發(fā)新的新冠病毒診斷系統(tǒng)時，有的醫(yī)學(xué)實驗室已經(jīng)開始使用PCR檢測。這種測試的主要缺點是需要復(fù)雜的實驗室、訓(xùn)練有素的人員和昂貴的熱循環(huán)器，而所有這些都供不應(yīng)求。Molina和同事專注于利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）創(chuàng)造一種更簡單、更便宜的測試方法。“LAMP的機器只是一臺加熱器，而且我們知道這項技術(shù)的特性。”Molina說。
除了使用更簡單的設(shè)備進行DNA擴增外，研究人員還盡可能簡化從樣本收集到結(jié)果報告的所有工作。2020年6月，該系統(tǒng)的最后一次迭代在美國和歐盟獲得了市場批準(zhǔn)，患者向試管中吐唾液后40分鐘就能產(chǎn)生可靠的結(jié)果。在這個過程的最后，智能手機應(yīng)用程序?qū)⒆x取試劑盒結(jié)果。“然后，你馬上就有了格式化的測試結(jié)果，陽性或陰性，信息會自動發(fā)送到數(shù)據(jù)庫。”Molina表示。即使是受過最低程度訓(xùn)練的技術(shù)人員也幾乎可以在任何地方開展測試。
從Sys2Diag分離出來的SkillCell公司現(xiàn)在以EasyCOV的名稱出售這種測試系統(tǒng)。Molina說，它可以在世界各地的機場、醫(yī)院、診所和各種需要對員工進行檢測的行業(yè)中使用。它與其他快速檢測病毒產(chǎn)品競爭，例如雅培的ID NOW COVID-19系統(tǒng)，該系統(tǒng)也使用等溫擴增技術(shù)。
免疫計數(shù)
雖然許多生物學(xué)家和生命科學(xué)公司改變了工作重點，以幫助對抗這種新病毒，但另一些人則只是在大流行病來臨之際繼續(xù)常規(guī)工作。世界上最大的實驗室及診斷試劑和設(shè)備供應(yīng)商之一珀金埃爾默（PerkinElmer）便是如此。“我們的目錄上有幾千種產(chǎn)品，當(dāng)大流行病發(fā)生時，我們立即注意到了這一點。”珀金埃爾默子公司——歐蒙醫(yī)學(xué)（EUROIMMUN US）科學(xué)事務(wù)經(jīng)理Iswariya Venkataraman表示。
2019年12月，當(dāng)新冠病毒暴發(fā)的范圍變得清晰時，歐蒙醫(yī)學(xué)開始開發(fā)檢測病毒的PCR測試，以及針對病毒抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。Venkataraman指出：“我們的首要任務(wù)是能診斷感染，然后了解感染后的體液免疫反應(yīng)。”盡管在疫情大流行早期，識別并隔離感染者的迫切需要占據(jù)了大部分注意力，但公共衛(wèi)生官員很快意識到抗體篩查的重要性。
2020年5月初，歐蒙醫(yī)學(xué)獲準(zhǔn)進行快速定性檢測，以檢測針對新冠病毒刺突糖蛋白的抗體。該測試使用純化的刺突S1結(jié)構(gòu)域（通常被認為是病毒上最特異性的抗原靶點），將任何醫(yī)學(xué)檢測實驗室都熟悉的標(biāo)準(zhǔn)ELISA程序與免疫球蛋白G（IgG）抗體結(jié)合。IgG在感染晚期出現(xiàn)，被認為是基于抗體的體液免疫的良好長期標(biāo)記物。Venkataraman表示：“對于IgG抗體來說，中位發(fā)病時間大約是（感染后的）第14或15天。”
隨著疫情大流行的持續(xù)，定性檢測顯示，個人對病毒的免疫反應(yīng)存在很大差異，一些人在感染數(shù)周內(nèi)檢測出抗體呈陰性，而另一些人感染數(shù)月后仍呈陽性。與此同時，疫苗開發(fā)人員正在加緊進行臨床試驗，他們不僅需要知道產(chǎn)品能否引發(fā)抗體反應(yīng)，而且需要知道這些反應(yīng)有多強烈。歐蒙醫(yī)學(xué)通過校準(zhǔn)他們建立的定性測試來滿足這一需求。“這是完全相同的抗原靶點，只是增加了校準(zhǔn)器來定量。”Venkataraman說。該公司于2020年12月發(fā)布了名為QuantiVac的新測試試劑盒。
目前，QuantiVac在歐洲作為定量測試、在美國作為半定量測試試劑盒銷售。區(qū)別是由于美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）要求定量檢測基于既定的國際參考標(biāo)準(zhǔn)，而目前尚不存在針對新冠病毒抗體的參考標(biāo)準(zhǔn)。“當(dāng)有可用的國際標(biāo)準(zhǔn)時，我們將校準(zhǔn)化驗結(jié)果。”Venkataraman說。
QuantiVac試劑盒包括一套6個參考樣本，代表一系列抗體濃度。Venkataraman指出，“有了這些數(shù)據(jù)，你就可以繪制出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。一旦有了一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以確定樣本中未知的濃度。”他補充道，疫苗開發(fā)人員和免疫學(xué)家應(yīng)該會發(fā)現(xiàn)，定量數(shù)據(jù)對詳細描述患者免疫反應(yīng)很有用。
抗體可以看出差異
其他專注于診斷測試的公司也走了類似的道路，有著類似的時間表。“2020年2月，我們討論了抗體檢測在疫情大流行管理中可能發(fā)揮的作用。”位于德國潘茨堡的羅氏診斷公司免疫檢測開發(fā)和系統(tǒng)集成主管Beatus Ofenloch-Haehnle表示。2020年3月的第二周，他和同事正在改進現(xiàn)有的羅氏檢測方法，以檢測新冠病毒抗體，由此產(chǎn)生的病毒接觸的定性分析6周后在歐洲和美國推出。
與歐蒙醫(yī)學(xué)的檢測不同，羅氏定性檢測識別的是針對新冠病毒核衣殼蛋白的抗體反應(yīng)，而不是刺突糖蛋白。該測試使用的不是標(biāo)準(zhǔn)的ELISA，而是羅氏專利Elecsys電化學(xué)發(fā)光免疫分析法。在這種技術(shù)中，兩種不同的抗原制劑分別與不同的偶聯(lián)物結(jié)合，與樣本中的抗體結(jié)合，并將其連接到磁珠和發(fā)光標(biāo)記物上。然后，磁鐵沉淀抗體結(jié)合珠，外加電壓使沉淀的抗體三明治發(fā)光。
整個測試在羅氏完善的cobas自動化平臺上運行。“我們有20年的經(jīng)驗來開發(fā)各種免疫分析方法。”Ofenloch-Haehnle指出。由于Elecsys的硬件已經(jīng)被用于世界各地超過4萬個診斷和研究實驗室的其他分析，新冠病毒暴露測試對用戶來說很容易采用。
高水平的自動化和數(shù)十年的用戶界面改進，意味著cobas驅(qū)動的Elecsys檢測方法對新手來說也很容易上手。Ofenloch-Haehnle表示，許多實驗室第一次購買cobas系統(tǒng)只是為了運行新冠病毒測試。12微升的血液樣本，整個過程持續(xù)18分鐘。最大的cobas系統(tǒng)每小時可以完成300個測試，技術(shù)員只需要加載和卸載樣本。
因為能檢測病毒核衣殼，因此羅氏定性檢測對于識別感染病毒的個體很有用。然而，目前所有處于臨床開發(fā)后期階段的疫苗都只針對外部刺突糖蛋白激發(fā)免疫反應(yīng)，而Elecsys的新冠病毒定性檢測無法檢測到這些抗體。“我們決定開發(fā)第二種檢測，這次是定量檢測，因為你需要評估抗體水平并提出重新接種疫苗或免疫的潛在閾值。”Ofenloch-Haehnle表示。
2020年9月，羅氏的第二種檢測在歐洲和美國發(fā)布，使用相同的Elecsys平臺提供抗刺突保護性免疫球蛋白G的定量測量。這兩種檢測方法在某些情況下可以一起使用。“雖然核衣殼完全來自自然感染，但有了抗刺突試驗，人們可以在接種疫苗的個體中看到是否發(fā)生了自然感染，也可以區(qū)分人體對疫苗和自然感染的反應(yīng)。”Ofenloch-Haehnle解釋道。
“T”時間
盡管抗體檢測對于監(jiān)測疫情大流行的范圍和跟蹤疫苗反應(yīng)至關(guān)重要，但它們只測量了對新冠病毒免疫反應(yīng)的一個方面。除了通過抗體獲得體液免疫外，感染病毒的人還會通過“殺手”T細胞介導(dǎo)產(chǎn)生細胞免疫。“T細胞與身體對新冠病毒的反應(yīng)密切相關(guān)。”位于英國阿賓頓的牛津免疫技術(shù)公司首席執(zhí)行官Peter Wrighton-Smith指出。
然而，T細胞反應(yīng)更難以測量，而且研究和臨床實驗室都難以確定細胞免疫在新冠病毒中到底有多重要。“我們在學(xué)術(shù)文獻中遇到的一個問題是，研究結(jié)果都使用不同的方法。”Wrighton-Smith說。為了解決這個問題，他的公司開始為研究實驗室生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒，以測試人體面對新冠病毒時的T細胞反應(yīng)。這些試劑盒于2020年5月發(fā)布，隨后成為該公司與英國公共衛(wèi)生部合作進行的一項研究的核心，研究分析醫(yī)護人員和急救人員的T細胞反應(yīng)。
“我們一開始對人們進行了測試，然后在隨后的幾個月里跟蹤他們，看看誰感染了新冠病毒。”Wrighton-Smith說。結(jié)果顯示，T細胞介導(dǎo)的免疫是許多感染的共同特征。關(guān)鍵是，強大的T細胞反應(yīng)與對抗再感染的免疫力密切相關(guān)；沒有產(chǎn)生這種反應(yīng)的人更有可能再次感染。“在決定誰具有免疫力方面，T細胞可能比抗體更重要。”Wrighton-Smith說。
為了測量臨床環(huán)境中的細胞免疫，牛津免疫技術(shù)公司求助于T-Spot，這是他們開發(fā)了18年的平臺。通過這個系統(tǒng)，技術(shù)人員從血液樣本中分離出T細胞，計數(shù)并將它們分布到多孔板中，然后進行測定，以測量對測試抗原產(chǎn)生反應(yīng)的細胞數(shù)量。該公司的第一款產(chǎn)品T-SPOT.TB已經(jīng)在世界范圍內(nèi)用于追蹤細胞對結(jié)核病的反應(yīng)。“通過識別你是否有這些細胞，能夠確認你是否感染了或者最近是否接觸過新冠病毒。通過計算反應(yīng)的強烈程度，還可以告訴你免疫的程度。”Wrighton-Smith說。
T-SPOT Discovery則既可以用作定性檢測，也可以用作定量檢測。“我們正在為實現(xiàn)這一目標(biāo)而努力，（因為）我們有一種技術(shù)，我們認為它在疫情的下一階段會非常重要。”Wrighton-Smith表示。他強調(diào)，和其他研究新冠病毒的相關(guān)技術(shù)的人一樣，雖然有效疫苗的出現(xiàn)有望控制病毒，但對創(chuàng)新的需求——無論是針對這次疫情還是未來的大流行病，仍將持續(xù)存在。■
Alan Dove是馬薩諸塞州的科學(xué)作者和編輯。
鳴謝：“原文由美國科學(xué)促進會（www.aaas.org）發(fā)布在2021年1月22日《科學(xué)》雜志”。官方英文版請見https://www.science.org/content/article/pandemic-pivot-how-scientists-answered-call-diagnostic-tests。