Bridget Carragher表示，幾十年來，冷凍電鏡技術(shù)（cryo-EM）一直是一個“小眾且狹小”的領(lǐng)域。但在2017年，冷凍電鏡技術(shù)通過了蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank）——世界上唯一的蛋白質(zhì)、核酸和大型生物分子3D結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)資源庫——中多項(xiàng)年度條目的核磁共振波譜（NMR）�，F(xiàn)在，它正在超越結(jié)構(gòu)方法的鼻祖——X射線晶體學(xué)。
Carragher在紐約結(jié)構(gòu)生物學(xué)中心領(lǐng)導(dǎo)一個由美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）和西蒙斯基金會支持的冷凍電鏡設(shè)施。另外兩個NIH資助的中心在斯坦福大學(xué)和俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)（OHSU）。奧爾胡斯大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)家Poul Nissen表示：“各地的趨勢是使用國家冷凍電鏡設(shè)施。”
隨著軟件和硬件的突破，特別是在電子探測器方面的突破，國家中心服務(wù)的冷凍電鏡技術(shù)團(tuán)體正在迅速擴(kuò)大，展示了冷凍電鏡技術(shù)是如何推進(jìn)基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)甚至太陽能電池技術(shù)的。
晶體分辨率——沒有晶體，但要付出代價
與X射線晶體學(xué)不同，冷凍電鏡技術(shù)不需要結(jié)晶樣品，這省去了一個耗時的步驟，并允許在原子級重建塊狀復(fù)合體和完整的膜蛋白，阻止結(jié)晶。它可以顯示構(gòu)象的變化，例如核糖體在蛋白質(zhì)合成過程中會彎曲其結(jié)構(gòu)。
冷凍電鏡技術(shù)適用于未染色的水性樣品。對于單粒子分析（SPA），這是其最常見的應(yīng)用。研究人員將樣品放到一個網(wǎng)格上，該網(wǎng)格通過注入液態(tài)乙烷急速冷卻。這種冷凍——或者更確切地說是玻璃化——是如此之快，以至于樣品分子被固定，其結(jié)構(gòu)得以保持不變，而且沒有干擾透射電子顯微鏡（TEM）的冰晶。然后，研究人員通過將電子束穿過樣品來拍攝數(shù)千張TEM圖像。以隨機(jī)方向捕獲的分子會散射電子，從而創(chuàng)建用于生成3D模型的模式。
NIH冷凍電鏡技術(shù)中心副主任Craig Yoshioka指出了一個很有前途的發(fā)展：通過截短或突變蛋白質(zhì)來誘變成晶體的晶體學(xué)家，現(xiàn)在可以使用冷凍電鏡技術(shù)研究完整的野生型蛋白質(zhì)。“這應(yīng)該能更好地代表其天然狀態(tài)的靶標(biāo)，包括像糖基化這樣的翻譯后修飾。”
目前，SPA最適用于200kDa左右的大樣本，所以研究較小蛋白質(zhì)的研究人員可能會轉(zhuǎn)向微晶電子衍射（microED），這是一種具有更大尺寸范圍的冷凍電鏡技術(shù)。SPA的另一個問題是它使用細(xì)胞提取物，但在細(xì)胞內(nèi)部，“蛋白質(zhì)不是漂浮在水中的。它們與其他成分相互作用或形成網(wǎng)絡(luò)，在提取過程中破裂”，加州大學(xué)圣地亞哥分校生物物理學(xué)家Elizabeth Villa表示。Villa使用冷凍電子斷層掃描技術(shù)（cryo-ET）對細(xì)胞甚至組織切片進(jìn)行成像，從而在原位可視化組件。
而且冷凍電鏡技術(shù)有一個最大的缺點(diǎn)：成本。頂級的300千電子伏特（keV）冷凍電鏡機(jī)器價值約為500萬至700萬美元。
制藥公司可能有內(nèi)部設(shè)施或使用像NanoImaging Services這樣的公司提供的設(shè)備。該公司聯(lián)合創(chuàng)始人Carragher指出，大多數(shù)冷凍電鏡客戶來自制藥或生物技術(shù)公司，示例項(xiàng)目包括分析疫苗、抗體和藥物靶標(biāo)。在冷凍電鏡承包商中，該公司是少有的擁有自己設(shè)備的公司，而其他公司通常使用合作機(jī)構(gòu)的設(shè)備。
主要的研究機(jī)構(gòu)也投資于冷凍電鏡設(shè)備，但規(guī)模較小的大學(xué)負(fù)擔(dān)不起。然而，包括Gabriel Lander團(tuán)隊(duì)在內(nèi)的斯克里普斯研究所的科學(xué)家們使用功率較低的100keV或200keV顯微鏡揭示了蛋白質(zhì)的單埃（Å）結(jié)構(gòu)，花費(fèi)了100萬~200萬美元。這些結(jié)果鼓勵了那些呼吁使用更實(shí)惠、更耐用的儀器使冷凍電鏡技術(shù)大眾化的科學(xué)家。
共同體服務(wù)
由于新的NIH中心擁有尖端設(shè)備并專注于服務(wù)和培訓(xùn)，冷凍電鏡技術(shù)的使用應(yīng)該會增加，而且培訓(xùn)中心的人員不得成為用戶出版物的合著者。據(jù)Yoshioka估計(jì)，在滿負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn)的情況下，俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)站點(diǎn)將在同一時間收集200~300個活躍項(xiàng)目的24/7全天候數(shù)據(jù)，每年培訓(xùn)50多名來訪科學(xué)家。他預(yù)計(jì)每個中心每年將會進(jìn)行數(shù)百次重建。
而且服務(wù)是免費(fèi)的。“你寫了一份提案。”Carragher說，“如果它基于科學(xué)價值、可行性和需求等標(biāo)準(zhǔn)被接受，你就會得到冷凍電鏡技術(shù)的使用時間。”這個模型類似于國家同步加速器設(shè)施，而且還有許多這樣的設(shè)施，例如英國鉆石光源的電子生物成像中心和巴西能源和材料研究中心的巴西納米技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室（LNNano），都位于同步加速器附近。
LNNano研究員Rodrigo Portugal表示，工業(yè)客戶需要支付服務(wù)費(fèi)用，但在項(xiàng)目評估后，對學(xué)術(shù)研究人員的服務(wù)和培訓(xùn)是免費(fèi)的。
LNNano高級科學(xué)家Marin van Heel指出，冷凍電鏡技術(shù)是基于結(jié)構(gòu)的藥物和疫苗設(shè)計(jì)的強(qiáng)大工具，由于“像寨卡等被忽視的疾病的需求巨大”，因此它在該地區(qū)至關(guān)重要。LNNano正在與巴西、秘魯、烏拉圭和阿根廷的合作伙伴進(jìn)行SPA研究。
除了成本，LNNano設(shè)施的主要負(fù)擔(dān)是人才流失。盡管舉辦了多場研討會和一年一度的巴西單粒子冷凍電鏡學(xué)院，但“人們還是會被另一個國家的中心或制藥公司挖走”，van Heel直言。
“這是問題所在”
冷凍電鏡技術(shù)的軟件和硬件已經(jīng)得到了“突飛猛進(jìn)”的發(fā)展。Yoshika說：“但要可靠地將任何蛋白質(zhì)從基因中提取到結(jié)構(gòu)中仍然很困難。”冷凍電鏡技術(shù)不需要大晶體，但樣品純度、異質(zhì)性和濃度仍然很重要。
“樣品準(zhǔn)備不是問題。”Carragher說。在玻璃化過程中，“顆粒自身會粘合在一起，粘附在空氣—水界面上，形成不穩(wěn)定的構(gòu)象或者解體。”商用自動化系統(tǒng)使樣品制備更加可靠。然而，下游的挑戰(zhàn)是由需要專用工作站的tb級數(shù)據(jù)引起的。
數(shù)字化的發(fā)展
冷凍電鏡技術(shù)的用戶們一致稱贊軟件小組在數(shù)據(jù)分析和結(jié)構(gòu)解析方面的進(jìn)步。Yoshioka表示，開源軟件如來自英國醫(yī)學(xué)研究委員會分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室Sjors Scheres的RELION，以及包括Janelia研究園區(qū)和馬薩諸塞大學(xué)的Niko grigoriieff在內(nèi)的其他人的工作對該領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。他指出，計(jì)算技術(shù)的一個新興的進(jìn)步是數(shù)據(jù)收集時的實(shí)時處理和重構(gòu)。
這正是cryoSPARC Live所做的。該軟件由多倫多大學(xué)的子公司Structura Biotechnology開發(fā)，目前正在進(jìn)行beta測試，該公司由Ali Punjani和Saara Virani兄妹團(tuán)隊(duì)運(yùn)營。CryoSPARC Live增加了SPA工具的CryoSPARC包，包括2D圖像管理和3D重建，而無需事先了解結(jié)構(gòu)知識。
Virani指出，CryoSPARC Live會在幾分鐘后顯示初始圖像，在大約一小時內(nèi)顯示6-Å到8-Å的3D結(jié)構(gòu)，并在幾小時后顯示精細(xì)的高分辨率結(jié)構(gòu)。她說，研究人員可以進(jìn)行實(shí)時調(diào)整，比如移動樣本以專注于最佳領(lǐng)域，并決定要收集多少數(shù)據(jù)，從而節(jié)省時間和金錢。隨著冷凍電鏡技術(shù)需求的迅速增長，該領(lǐng)域正在努力解決商業(yè)化問題。Punjani解釋道，cryoSPARC對學(xué)術(shù)用戶是免費(fèi)的，而制藥公司等商業(yè)客戶必須購買許可證。
Punjani指出，從冷凍電鏡技術(shù)大眾化的計(jì)算角度來看，是為了改進(jìn)算法，以從低端顯微鏡獲得更好的圖像。此外，云托管的計(jì)算可以讓實(shí)驗(yàn)室根據(jù)需要租用處理時間，而不用投資專用的硬件。
全力以赴創(chuàng)新
“在一段時間內(nèi)，單粒子將成為高分辨率冷凍電鏡技術(shù)的基本方法。”Yoshioka說。其他領(lǐng)域的進(jìn)展擴(kuò)大了解析結(jié)構(gòu)的尺寸范圍，并允許細(xì)胞內(nèi)部的視圖。
獲得小于100kDa的蛋白質(zhì)的高分辨率圖像，推動了目前SPA的極限。由Tamir Gonen團(tuán)隊(duì)開發(fā)的MicroED實(shí)現(xiàn)了尺寸范圍超過200kDa的配合物到10個碳原子以下的有機(jī)分子的原子分辨率。在加州大學(xué)洛杉磯分校工作的Gonen解釋稱，MicroED使用的晶體尺寸是X射線晶體學(xué)所需尺寸的十億分之一。在MicroED中，玻璃化作用保護(hù)了樣品，從而使單個微晶體通過電子束旋轉(zhuǎn)而產(chǎn)生衍射圖案，捕捉其分子三維重建的所有角度。
Gonen使用MicroED來觀察鈉離子通過通道時的結(jié)構(gòu)變化。“因?yàn)槲覀兪褂玫木w只包含大約1000個單元，我們可以梳理出較小的差異，并捕捉到過渡態(tài)。”
藥物化學(xué)家、法醫(yī)學(xué)家和藥物開發(fā)人員都對MicroED“粉末到結(jié)構(gòu)”的應(yīng)用感到興奮。Gonen的研究小組和其他研究人員發(fā)表了一種30分鐘內(nèi)通過結(jié)構(gòu)（包括混合物）識別小分子（如布洛芬或生物素）的方法。
Gonen與賽默飛世爾科技公司合作開發(fā)了相對易于使用的MicroED硬件和軟件。“現(xiàn)在你不需要知道太多，就可以將樣本放入‘范圍’并收集數(shù)據(jù)。它可以讓學(xué)界更容易獲得MicroED。”他說。賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品營銷總監(jiān)Steve Reyntjens表示，MicroED套件很容易作為一個可選項(xiàng)目添加到新顯微鏡上，或作為現(xiàn)有儀器的改裝件。
加州大學(xué)洛杉磯分校的David Geffen 醫(yī)學(xué)院有一個MicroED中心，其與學(xué)術(shù)和行業(yè)科學(xué)家合作并提供MicroED培訓(xùn)，包括在2020年10月舉行的年度峰會上提供培訓(xùn)。
Villa指出，Cryo-ET揭示的細(xì)胞內(nèi)容并不像教科書或視頻中出現(xiàn)的那樣“有一個空的空間，一個粒子，然后是空的空間”，它顯示細(xì)胞中充滿了分子。
TEM需要比大多數(shù)細(xì)胞更薄的樣品，所以像Villa這樣的研究人員將cryo-ET與聚焦離子束（FIB）微加工技術(shù)結(jié)合起來。Villa認(rèn)為紐約州衛(wèi)生部的Mike Marko證明了這種典型的材料科學(xué)方法對玻璃化樣品是可行的。作為馬克斯•普朗克生物化學(xué)研究所Wolfgang Baumeister實(shí)驗(yàn)室的博士后，Villa幫助推動了這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展。
Cryo-FIB使用一種特殊的冷凍電鏡儀器，該儀器將一束大型離子束對準(zhǔn)玻璃化樣品以使其平整。“從細(xì)胞的頂部和底部進(jìn)行爆破，直到細(xì)胞側(cè)面有一個足夠薄的窗口，就可以進(jìn)行cryo-ET。”Villa說。
Villa的實(shí)驗(yàn)室在cryo-ET中添加了相關(guān)的光電子顯微鏡（CLEM），以確定LRRK2的14-Å結(jié)構(gòu)。研究人員標(biāo)記了這種與帕金森病有關(guān)的蛋白質(zhì)，以使用CLEM將其定位到細(xì)胞中。然后，他們使用FIB對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)化，以獲得LRRK2的原位3D結(jié)構(gòu)，包括其與微管密切相關(guān)。LRRK2不能結(jié)晶，“但通過cyro-ET和亞斷層圖像平均，我們解決了它在細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)問題”，Villa說。
根據(jù)Villa的說法，未來對cyro-ET技術(shù)的改進(jìn)包括在誘導(dǎo)改變之前，開發(fā)專門的TEM網(wǎng)格來培養(yǎng)細(xì)胞。Villa指出，使用光學(xué)顯微鏡的研究人員可以選擇何時將樣本玻璃化以進(jìn)行cyro-ET實(shí)驗(yàn)，以高分辨率觀察你對細(xì)胞進(jìn)行某些操作時發(fā)生的情況。
cyro-ET的樣品制備是低通量的，但是歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室John Briggs小組開發(fā)的一種具有多重?zé)晒鈽?biāo)記的CLEM變體可以更快地識別cyro-ET細(xì)胞。Nissen說，cyro-ET將允許在其原生環(huán)境和整個組織中觀察分子，例如神經(jīng)元間相互作用的“連接體”的分子視圖。
美國國立衛(wèi)生研究院將很快啟動國家cyro-ET中心。Carragher解釋道，當(dāng)前的冷凍電鏡中心會在用戶準(zhǔn)備好cyro-ET樣本時收集斷層掃描圖。國家中心將提供設(shè)備使用權(quán)，并協(xié)助進(jìn)行棘手的cyro-ET標(biāo)本制備。
除了像CLEM這樣的發(fā)展之外，結(jié)合冷凍電鏡技術(shù)和來自多個來源數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)分析正在興起。“人們越來越多地使用晶體學(xué)、核磁共振、CLEM、質(zhì)譜等各種方法來得到答案。但如果我們希望每個人都能擁有這些工具，它們就需要更容易獲得。” Carragher說。
新的抱負(fù)
Nissen觀察到，在解決訪問問題的同時，該領(lǐng)域應(yīng)該將其視角從只關(guān)注結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)樵儐柦Y(jié)構(gòu)在其原生狀態(tài)下在細(xì)胞中的作用。“在自然環(huán)境中獲得無標(biāo)簽、時間解析的結(jié)構(gòu)是我們的最終目標(biāo)，也是培養(yǎng)學(xué)生和博士后的一個新目標(biāo)。”
Nissen和其他人預(yù)測，冷凍電鏡技術(shù)在開發(fā)抗體療法、小分子藥物和診斷方面的工業(yè)應(yīng)用將會越來越多。“我們還應(yīng)該與醫(yī)學(xué)界合作，解決尚未滿足的診斷需求。在這些需求中，組織學(xué)無法顯示出疾病組織和健康組織之間的良好區(qū)別，我們可以通過使用cryo-ET來發(fā)現(xiàn)組織中的分子差異。”
van Heel幫助開發(fā)了冷凍電鏡技術(shù)，并目睹了它的使用增長。他在談到該領(lǐng)域工作時指出：“目前這很具有挑戰(zhàn)性，這是一個偉大的生存時代，沒時間度假了。”■
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Chris Tachibana 是生命科學(xué)領(lǐng)域的自由撰稿人。
鳴謝：“原文由美國科學(xué)促進(jìn)會（www.aaas.org）發(fā)布在2020年3月20日《科學(xué)》雜志”。官方英文版請見https://www.science.org/content/article/democratizing-cryo-em-broadening-access-expanding-field。