為了找到新的思路，科學(xué)家們有時會查閱幾十年前發(fā)表的研究報告。這就是Wendy Gilbert最近在RNA修飾研究中所做的。轉(zhuǎn)運RNA（tRNAs）和信使RNA（mRNAs）富含腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶的150多種修飾變體。假尿苷在rRNA和tRNA中含量豐富，但是當(dāng)Gilbert在2013年開始她的研究時，沒有人知道這種修飾是否存在于mRNA中。
身為耶魯大學(xué)副教授的Gilbert，轉(zhuǎn)而查閱新澤西州羅氏研究中心（Roche Research Cente）的生物化學(xué)研究人員于1993年發(fā)表的一項研究。在這項研究中，Andrey Bakin和James Ofengand給RNA中的假尿苷添加了一個龐大的化學(xué)基團。他們發(fā)現(xiàn)，這種超大型的假尿苷阻礙了逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)RNA模板生成互補DNA（cDNA）的作用，阻礙了逆轉(zhuǎn)錄酶的運行。
Gilbert和她的同事隨后將該方法應(yīng)用于酵母細胞和人類細胞，采用新一代測序技術(shù)（NGS）來檢測產(chǎn)生的cDNAs。他們在基因組中幾百個人類基因的轉(zhuǎn)錄本上檢測到由假尿苷引起的過早截短的cDNA信號。而在其他幾個課題組的實驗中，也同時出現(xiàn)了假尿苷的mRNA圖譜。這種修飾的出現(xiàn)并不僅僅是一種偶然，它在mRNA上存在的水平隨著細胞壓力的變化而發(fā)生變化，這表明它具有調(diào)節(jié)作用。
像Gilbert這樣的研究是在全基因組水平上研究修飾相關(guān)論文潮流的一部分。除了涉及假尿苷的修飾外，其他一些修飾也得到了特別關(guān)注，尤其是N6-甲基腺苷（m6A），它在發(fā)育和疾病過程中對mRNA的調(diào)控起著關(guān)鍵作用。應(yīng)用于mRNA和長非編碼RNA研究的方法是新的，還有許多方法仍在理論測試階段，并需要反復(fù)試錯來加以驗證。
這些新方法也推動了新興的表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)這是一個定義松散的術(shù)語，它包括RNA修飾及其相關(guān)調(diào)節(jié)因子的生物學(xué)。“在未來，你不會認(rèn)為任何RNA分子僅僅是一種具有某種二級結(jié)構(gòu)的信息載體分子，”Christopher Mason如是說，他是紐約市威爾康奈爾醫(yī)學(xué)院的助理教授。“你會從如何修改、如何調(diào)控、如何包裝以及如何控制等方面來考慮它們。”
轉(zhuǎn)向mRNA修飾
與mRNAs相比，tRNA和rRNA修飾的檢測研究是較為成熟的領(lǐng)域。畢竟，這些非編碼RNA比mRNA含量更豐富，易于生化研究。尤其是tRNA可以進行質(zhì)譜分析，它的體積小到足以讓研究人員將修飾的化學(xué)成分和它在序列中的位置一起鑒定出來。此外，許多研究者認(rèn)為研究mRNA是一個更令人生畏的挑戰(zhàn)，因為它能改變細胞中那些巨大甚至稀有的功能分子。
到目前為止，對mRNA的修飾研究屈指可數(shù)。而其中一些備受爭議：研究人員爭論的焦點是它們的普遍性，它們的生物學(xué)相關(guān)性，以及“判定”修飾位點的分析是否足夠嚴(yán)格。
隨著現(xiàn)有技術(shù)的改進和新技術(shù)的發(fā)明，該領(lǐng)域的一些開放性問題將得到解決。在用來發(fā)現(xiàn)新的修飾和探測現(xiàn)有修飾的方法中，利用一些最成熟的抗體可以親和純化含有修飾的RNA。
寫—讀—擦
2012年完成的一項研究通過使用抗體親和純化法，繪制了m6A的修飾譜圖，人們普遍認(rèn)為這項研究開辟了一個新的領(lǐng)域。在2012年之前，有證據(jù)表明m6A可能在mRNA調(diào)控中起關(guān)鍵作用。在許多真核生物中都發(fā)現(xiàn)了它，例如在酵母產(chǎn)孢以及擬南芥組織分裂的過程中，它在mRNA上的修飾水平升高。
隨著NGS方法的出現(xiàn)，兩個研究小組對此進行了更深入的研究。一個是由Gideon Rechavi領(lǐng)導(dǎo)的舍巴醫(yī)療中心，它隸屬于以色列特拉維夫大學(xué)；另一個團隊包括Mason和Samie Jaffrey。Samie Jaffrey是威爾康奈爾醫(yī)學(xué)院的藥理學(xué)教授，也是一家總部位于紐約的生物科技公司Gotham Therapeutics的共同創(chuàng)辦人。
兩個研究團隊均使用m6A抗體親和純化含有該修飾的RNA片段。然后他們利用這些片段創(chuàng)建了cDNA文庫并對其進行了測序，生成了一張潛在的m6A位點圖。他們利用被稱為meRIP-Seq和m6A-seq的方法發(fā)現(xiàn)了數(shù)以千計的修飾。例如，Rechavi’s的小組在7000多個人類基因的轉(zhuǎn)錄本中發(fā)現(xiàn)了超過12000個m6A修飾位點。m6A同樣存在于哺乳動物的長非編碼RNA中。
研究者們已經(jīng)確定了與m6A相互作用的專用酶：“書寫者”負責(zé)將修飾添加到mRNA上，“閱讀者”負責(zé)實現(xiàn)其功能，而“擦除者”則負責(zé)移除這些修飾。他們已經(jīng)證明了m6A通常是在應(yīng)答刺激時調(diào)節(jié)mRNA的翻譯、穩(wěn)定性和剪接。在擬南芥中，m6A可以穩(wěn)定那些參與鹽和滲透脅迫反應(yīng)應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄本。在哺乳動物中，它似乎在學(xué)習(xí)和記憶、血細胞生成和X染色體失活等方面起作用。
這些發(fā)現(xiàn)反映了進化史上可能有一個時期，那時RNA可能作為一個中心分子，一些生物學(xué)家稱之為“RNA世界”。Rechavi說，“我確信，這將是基因表達調(diào)控的重要層面。”
“可成藥的領(lǐng)域”
這些發(fā)現(xiàn)也有可能對現(xiàn)實世界產(chǎn)生影響。“我們可以看到實際影響的初步成果，” Rechavi說，他指出，有幾項研究已經(jīng)將m6A修飾與癌癥聯(lián)系起來。例如，Tony Kouzaride和他的同事在英國劍橋大學(xué)格登研究所最近的一項研究表明，m6A的書寫者——METTL3（甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3）促進了急性髓系白血病細胞的生長。盡管大多數(shù)人對它們的存在保持沉默，但幾家生物技術(shù)初創(chuàng)公司正在進軍這一領(lǐng)域。
Kouzarides說：“這是一個有可能成藥的領(lǐng)域，而且其中有很好的靶點。”他也是英國劍橋Storm Therapeutics生物技術(shù)公司的共同創(chuàng)始人之一，該公司主要根據(jù)Kouzarides實驗室的研究結(jié)果開發(fā)產(chǎn)品。位于馬薩諸塞州劍橋市的Twentyeight-Seven Therapeutics公司，主要專注于RNA研究，其創(chuàng)始人Richard Gregory解釋說，像METTL3這樣的潛在靶點在結(jié)構(gòu)上與DNA甲基化酶相似，而DNA甲基化酶正是現(xiàn)有癌癥藥物的靶點。Accent Therapeutics公司則位于馬薩諸塞州列克星敦市，其科學(xué)聯(lián)合創(chuàng)始人Chuan He表示，該公司正在對幾種RNA修飾蛋白開展研究。
同時，研究人員采用meRIP-Seq/m6A-seq方法去檢測其他修飾，例如N1-甲基腺苷（m1A）以及最近發(fā)現(xiàn)的N4-乙酰胞苷（ac4C）。他們正在開發(fā)基于抗體的新一代技術(shù)，如Jaffrey和同事開發(fā)的miCLIP，用于檢測m6A。該方法主要通過將抗體交聯(lián)到RNA修飾上，產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶的阻斷和cDNA的截短。與meRIP-Seq/m6A-seq生成的100-200個堿基對讀取相比，該方法更精確地確定了修飾的位置。
Rechavi提示道，要使這種方法達到最優(yōu)效果，一是要將經(jīng)驗證的抗體很好的粘附在預(yù)期靶標(biāo)上，二是盡量減少脫靶的結(jié)合。但在一個新方法和數(shù)據(jù)不斷受到挑戰(zhàn)的領(lǐng)域，這只是其中一個問題。
數(shù)據(jù)的分歧
在過去的幾年里，m6A和假尿苷的全轉(zhuǎn)錄組譜圖已經(jīng)產(chǎn)生，隨著綜合數(shù)據(jù)集變得越來越可靠，評估數(shù)據(jù)集質(zhì)量的研究正在興起。但是最近研究的一些修飾數(shù)據(jù)如m1A和2'-鄰甲基（Nm）-仍然是備受爭議。
這個領(lǐng)域的大多數(shù)方法都“適合于在數(shù)字較低的一端發(fā)現(xiàn)一些共同之處，隨后意見就會出現(xiàn)分歧”，德國美因茨大學(xué)藥物化學(xué)研究院副教授Mark Helm說。
當(dāng)“對什么是信號與什么不是信號的解釋有很大不同”時，就會產(chǎn)生爭議，海德堡的德國癌癥研究中心教授Michaela Frye補充道，他同時是Storm Therapeutics公司的一位顧問。
有幾篇綜述已經(jīng)解決了這樣的爭議，包括Helm、Jaffrey和其他人合著的論文。這些綜述概述了建立實驗質(zhì)控的方法，使用正交法驗證結(jié)果，并確保更嚴(yán)格的數(shù)據(jù)分析。研究人員還呼吁，進行更多的實驗來驗證RNA修飾位點是否是具有生物學(xué)功能的真實位點。例如，通過敲除或使用伊利諾伊州芝加哥大學(xué)Tao Pan小組開發(fā)的技術(shù)——SCARLET。SCARLET可以生化檢測和量化特定轉(zhuǎn)錄本中任何核苷酸的修飾殘基。然而，Gilbert說，這樣的驗證“幾乎從未完成過”。
但是，盡管任何新興領(lǐng)域都有這種反復(fù)，但有一個共識是需要新的實驗方法。
舊的變成新的
芝加哥大學(xué)的化學(xué)教授何川的研究目標(biāo)是，開發(fā)新的既可以定量又便于使用的表觀轉(zhuǎn)錄組方法。為了迎接這一挑戰(zhàn)，他獲得了國家人類基因組研究所為期五年、價值1060萬美元的資助。“該領(lǐng)域的主要需求是新技術(shù)”他說。
研究人員最終希望找到一種方法，能夠精確地說明基因修飾在基因組上的位置，同時也能量化mRNAs和非編碼RNAs中該修飾所占比例。具有這種潛力的方法包括對單個RNAs進行測序的新興技術(shù)，例如納米孔測序，即用電流將RNA分子穿過膜上的一個小孔，然后通過測量電流的變化來讀取序列。
由西班牙巴塞羅那基因組調(diào)控中心的Mason 和Eva Maria Novoa組成的團隊，在BioRxiv上發(fā)表的一項新的研究，令人感興趣的是，用納米孔測序檢測m6A的準(zhǔn)確率為90%。
一些研究人員樂觀地認(rèn)為，納米孔技術(shù)將大大提高精確度，但其他研究人員則持遲疑態(tài)度。“我喜歡這種方法，因為我認(rèn)為它可以解決所有問題，”Frye說，但她指出，檢測極為罕見的修飾是一個挑戰(zhàn)，即使使用的方法只是稍稍有點不準(zhǔn)確。
其他更遠期的方法包括改進質(zhì)譜方法以應(yīng)用于mRNA檢測，或提升成像技術(shù)，這些技術(shù)改良目前仍處于起步階段，Sara Rouhanifard說。她是在波士頓麻省理工學(xué)院生物工程專業(yè)的助理教授。
何川的課題組目前正在研究與二代測序或其他測序方法相串聯(lián)的技術(shù)。“希望在兩年內(nèi)，人們可以從一家公司購買一套包含‘多種方法’的試劑盒”，他說，“然后使用他們可以下載的軟件，做自己想做的任何事。”例如，他的小組就應(yīng)用定向進化的方法來產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶，將堿基改變引入cDNA，以檢測不同的RNA修飾。
與此同時，Gilbert仍在回看歷史。她說，并非只有她一個人在審視舊的研究成果，她想看看能用什么樣的方法“轉(zhuǎn)變成下一代測序分析技術(shù)，這將有助于找到新的修飾。”她還渴望探索RNA結(jié)合蛋白如何調(diào)節(jié)和闡釋假尿苷傳遞的信息，它似乎沒有專門的mRNA 閱讀者或者書寫者，她補充道。
當(dāng)前和未來的工具
越來越多的研究人員開始對表觀轉(zhuǎn)錄組技術(shù)表現(xiàn)出興趣，尤其是對m6A修飾。
已經(jīng)有一些試劑盒可以用于meRIP-Seq/m6A-seq方法（例如，來自新英格蘭生物實驗室）。Jaffrey使用的是來自Abcam和Synaptic Systems的抗體。Jaffrey補充說，其他技術(shù)，比如miCLIP，需要更多的技巧，他已經(jīng)發(fā)布了miCLIP和meRIP Seq的詳細實驗方案。
以色列雷霍沃特的魏茨曼科學(xué)研究所的RNA研究人員Schraga Schwartz指出深入研究數(shù)據(jù)需要計算生物學(xué)方面的專業(yè)知識，盡管他相信隨著工具的發(fā)展，數(shù)據(jù)將變得更容易解釋。對m6A感興趣的研究人員，可以“大致了解數(shù)據(jù)是什么樣子的”，他說，但在不同條件下獲得可以定量比較的數(shù)據(jù)“要復(fù)雜得多”。
Mason鼓勵研究人員將他們的技能拓展到表觀轉(zhuǎn)錄組研究中來，“在生物學(xué)中，很少有這樣一個廣闊的領(lǐng)域等待被探索。在這種情況下，出現(xiàn)的問題是‘我的RNA修飾會影響我的某部分生物學(xué)功能嗎？’到目前為止，答案似乎總是‘是的’。”他說，“我認(rèn)為掌握這套技能的好處是，你可以很快點亮一道新的光線，從某個角度照亮你長期以來所關(guān)注的生物學(xué)問題，然后以新的方式看待它。”■
（譯者李楠是中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院的副研究員）
Charlotte Schubert是常駐在西雅圖的自由撰稿記者。
鳴謝：“原文由美國科學(xué)促進會（www.aaas.org）發(fā)布在2019年5月17日《科學(xué)》雜志”。官方英文版請見https://www.sciencemag.org/features/2019/05/epitranscriptomics-rna-revisited。