推陳出新：染色質免疫沉淀技術的新發(fā)展

   染色質免疫沉淀（ChIP）是分子生物學中應用最廣泛的技術之一，它已經(jīng)有30多年的歷史，有些技術已經(jīng)發(fā)生了變化，而有些則保持不變。

   ChIP的基本操作方案仍與上世紀80年代開發(fā)的方案類似，涉及用甲醛將蛋白質與DNA交聯(lián)，然后對DNA進行剪切。對于與DNA相互作用的蛋白質使用抗體進行免疫沉淀，加熱解除交聯(lián)，并分析捕獲的DNA。研究人員后來將這項技術與深度測序聯(lián)系起來，開發(fā)出ChIP-seq技術，在基因組層面探索蛋白質與DNA的相互作用。

   ChIP被廣泛地用于研究轉錄因子工作原理、組蛋白對基因表達的調控機理以及其它與生物發(fā)育和疾病相關的基本問題。2018年9月，C. David Allis和Michael Grunstein因基于ChIP的組蛋白研究成果獲得著名的拉斯克獎。ChIP-seq現(xiàn)在是ENCODE（DNA元件百科全書）項目的基石，該項目旨在繪制各種細胞類型中基因組的調控區(qū)域。

   染色質研究者們也在開發(fā)一種點陣技術，以超越或者拓展已有的ChIP和ChIP-seq技術，用來檢測蛋白質復合物，更準確地鑒定某個蛋白因子結合的具體核苷酸，研究小量的細胞樣品，甚至開始在單細胞水平初步探索蛋白質-DNA的相互作用。

   所有這些技術都旨在完成ChIP-seq單獨無法完成或只能緩慢完成的任務。它們都有一個共同的基本目標：找出與DNA相關的分子以及它們的位置。

   位于馬薩諸塞州坎布里奇市的Broad研究所表觀基因組學項目主任Bradley Bernstein表示：“我們真的不了解基因組中調控功能序列決定基因何時何地表達的基本原理。”他補充說，ChIP “在很多方面都有局限性。因此，人們努力嘗試和發(fā)明新方法或以新方式改良技術”。

 

為經(jīng)典技術賦能

 

   “把ChIP-seq稱為黑魔法有點太過分。”以色列耶路撒冷希伯來大學計算機科學和生物學教授Nir Friedman表示。但盡管這是一種常用的技術，“很少有人有足夠的耐心來校準他們的實驗”。

   Friedman指出，ChIP-seq實驗會產(chǎn)生很多噪音。甲醛可以使未參與反應的分子交聯(lián)，抗體可以捕獲非靶蛋白，而超聲波作為最常見的分解DNA的方法，更傾向于分解處于開放構象的DNA。他說：“有可能超過一半的測序或觀察的結果是非特異性結合的。”

   Friedman介紹，ENCODE發(fā)布了評估抗體質量和篩選無意義數(shù)據(jù)的指導方針。該項目還提供了對最新計算工具的訪問地址，例如，將實驗組與對照組數(shù)據(jù)歸一化的方法和識別可能的DNA結合的“峰值”或區(qū)域的方法。

   特別是，選擇正確的抗體是一項挑戰(zhàn)，北卡羅來納州達勒姆研究三角公園的表觀遺傳學公司EpiCypher首席科學官Michael-Christopher Keogh指出。Keogh參與了最近的一項研究，該研究表明，許多在組蛋白研究中被廣泛使用的抗體在ChIP中表現(xiàn)不佳，例如與非靶標蛋白的表位結合。該研究還提出了ENCODE準則之外的驗證步驟。

   一些研究人員通過在他們的目標上設計一個抗原決定簇標簽來繞過抗體問題，比如CETCh-seq（CRISPR抗原決定簇標簽ChIP-seq）。一個長期存在的技術——DamID（DNA腺嘌呤甲基轉移酶鑒定）是利用工程化的蛋白因子和標簽分子來標記相鄰的DNA。

   還有一些研究人員仍在改進基本的ChIP技術，比如加州大學圣地亞哥分校醫(yī)學部的Alon Goren團隊，他們已經(jīng)開發(fā)出了自動化的ChIP-seq。Goren說，抗體和細胞類型之間的最佳抗體濃度可能有很大差異，某些步驟（如解交聯(lián)）是不必要的。Goren實驗室還表明單克隆抗體優(yōu)于多克隆抗體。

   但是，即使在完全優(yōu)化之后，ChIP-seq從根本上仍然是有局限性的。Goren說，例如通常需要10萬個或更多的細胞來研究轉錄因子，需要1萬個或更多的細胞來研究組蛋白。在大多數(shù)情況下，這種方法每次只針對一種蛋白質、一種抗體。

   Goren說：“一旦我們能夠將思考的對象從蛋白質轉向復合物，我們就能更好地理解生物是如何工作的以及在疾病中會發(fā)生什么。”

 

給蛋白質復合物加一個把手

 

   研究復合物的一種方法是將ChIP-seq與質譜（MS）相結合，使用RIME（內(nèi)源性蛋白質的快速免疫沉淀質譜）和ChIP-MS等方法。

   然而，費城賓夕法尼亞大學的分子生物學專家David Steger說，這些方法的一個缺點是，與DNA無關的蛋白質也可以通過免疫沉淀被拉下來。“每個人都在努力開發(fā)針對特定增強子的位點特異性蛋白質組學。”

   鑒定染色質結合復合物的一種新興技術是ChIP-SICAP（選擇性分離染色質相關蛋白），其由德國海德堡德國癌癥研究中心的Jeroen Krijgsveld和他的同事開發(fā)。這項技術包括用生物素標記抗體結合的DNA，然后用鏈霉親和素珠子將生物素化的分子進行捕獲，隨后利用質譜進行分析。

   Steger正在應用ChIP-SICAP檢測與促進間充質干細胞向脂肪細胞轉化的增強子結合的蛋白質。Steger說：“我們正在嘗試鑒定一個增強子蛋白質組。”

   有些方法還利用Cas9的基因編輯系統(tǒng)，其中包括能識別特定DNA序列的向導RNA。研究人員已經(jīng)用生物素或一種酶標記了Cas9，這種酶可以促進附近蛋白質的生物素標記，MS.分析了這些蛋白質。這樣的方法可能會擴展ChIP-seq相關的方法，評估基因組的三維結構，如Hi-C、ChIA-PET（通過配對末端標記測序進行染色質相互作用分析）和HiChIP以及更新型的方法，如SPRITE（通過標記擴展進行相互作用的分類識別）。

   這些檢測DNA結合復合體的新方法有望使生物學研究人員對基因調控的認識更加清晰。但是當它們被用于質譜分析時，它們面臨的限制是不容易檢測到低豐度蛋白質，Steger說。此外，并非所有較新的技術都適合非專業(yè)人士使用。

   有幾家公司提供RIME或ChIP-seq等相對成熟技術的外包服務。提供ChIP-seq和相關服務的公司包括加利福尼亞州卡爾斯巴德的Active Motif公司、位于比利時列日和新澤西州登維爾的Diagenode以及北京的Novogene。這些公司和其他公司也提供ChIP-seq試劑盒和試劑耗材，不過很多實驗室都有自己的試劑。Keogh還指出，內(nèi)部研究可能意味著對優(yōu)化步驟的更好控制。

   Cigall Kadoch的團隊在Dana-Farber癌癥研究所和馬薩諸塞州波士頓的哈佛醫(yī)學院研究一些大型的蛋白質復合物。他說，在ChIP實驗過程中對實驗參數(shù)的關注可以提高數(shù)據(jù)的質量。

   Kadoch仔細優(yōu)化甲醛的濃度，在應用不同抗體和細胞類型時，甲醛的作用是將各種蛋白質與DNA相互交聯(lián)。當選擇抗體時，她提醒研究人員應該預測抗原決定簇是否會出現(xiàn)在蛋白表面，從而可以實現(xiàn)免疫沉淀。為了了解一個完全組裝好的復合物的DNA足跡，她建議選擇一種在組裝過程后期加上的蛋白質的抗體。“這些是決定項目成敗的因素。” 

 

關注蛋白因子的結合

 

   Steger使用的另一種技術是ChIP-exo（ChIP外切酶）。他將其應用于各種蛋白因子結合在基因組上結合位置的鑒定，以達到堿基對水平的分辨率。

   這項技術開始于DNA的超聲破碎。外切酶將DNA（以5' -3 '方向）剪切到DNA通過甲醛與結合蛋白連接的邊緣。這種方法為結合因子提供了一個清晰的DNA“足跡”，它比使用ChIP-seq計算生成的推斷序列更精確。

   “我們總是從ChIP-seq開始，隨著問題的發(fā)展轉向ChIP-exo。”Steger說，他使用這項技術來評估糖皮質激素受體與DNA的結合，受體作為二聚體與相鄰的兩個短DNA序列結合。Steger能夠解決一個單體的結合，這是用ChIP-seq無法做到的。

   賓夕法尼亞州立大學帕克分校生物化學和分子生物學教授Frank Pugh的團隊最近簡化了ChIP-exo方法，并將其應用于常用的Illumina測序平臺。同樣，密蘇里州堪薩斯城斯托爾斯醫(yī)學研究所副研究員Julia Zeitlinger和同事發(fā)表了一項相關技術ChIP-nexus。這兩項進展都“很有希望”，加州斯坦福大學遺傳學系主任、基因組學和個性化醫(yī)學中心主任Michael Snyder表示。

 

測得更小也更深

 

   Friedman說，通過調整實驗參數(shù)，例如使用高質量的抗體，研究人員已經(jīng)能夠減少ChIP-seq所需的細胞數(shù)量。某些技術包括Friedman開發(fā)的一種使用條形碼測序適配器的技術，使樣本量減少。而一項名為“ChIPmentation”的新技術則減化了構建測序文庫的程序。

   一種進入實驗室的新方法是CUT&RUN（目標引導并利用核酸酶的切割和釋放），由華盛頓西雅圖Fred Hutchinson癌癥研究中心的Steve Henikoff和他的同事開發(fā)。該方法不需要甲醛交聯(lián)，也不需要超聲剪切DNA。相反，一種針對靶標蛋白的抗體與微球菌核酸酶（MNase）結合，后者能夠被鈣激活而切割靶標兩邊的DNA。接著，產(chǎn)生的DNA片段被測序。

   位于西雅圖的Altius生物醫(yī)學科學研究所所長John Stamatoyannopoulos說，與ChIP-seq相比，“它可以大大減少噪音，而得到有效信號”。這在一定程度上是因為核酸酶對DNA的干凈切割，而非位點特異性切割的水平較低。因此，CUT&RUN所需的DNA測序讀取量通常比ChIP-seq要少，從而獲得低成本，而且適用于細胞數(shù)量少得多的情況。Henikoff的團隊最近將這項技術應用于在1000個細胞中研究一種轉錄因子，以及應用于100個細胞檢測一種組蛋白修飾。Stamatoyannopoulos說，在他的實驗室里，這種方法已經(jīng)在很大程度上取代了ChIP-seq。

   CUT&RUN還具有比處理微量樣本更大的優(yōu)勢。分子生物學專家、哈佛大學教授Stuart Orkin稱贊這種技術具有“實質上的單核苷水平”的分辨率。通過對計算工具的微小調整，他的團隊能夠區(qū)分出控制胎兒血紅蛋白表達的轉錄因子的緊密結合位點。在獲得這一結果之前，他無法用常規(guī)ChIP免疫沉淀該轉錄因子，這可能是因為甲醛交聯(lián)隱藏了表位。他說，一換成CUT&RUN“馬上就成功了”。

   Henikoff的實驗室已經(jīng)采用了這項技術來評估DNA的長期三維相互作用，并使用第二抗體對分離出的片段進行免疫沉淀。該小組研究了同一蛋白質復合體上的兩個分子特征，這種方法對于研究諸如“哪些組蛋白標記的組合會影響不同的基因狀態(tài)”之類的問題可能很有幫助。

 

單細胞水平的工作

 

   對于許多分子生物學研究人員包括染色質研究者來說，單細胞是最后的要塞。

   Bernstein說：“我們需要用精準的、確定性的方法直接評估單個細胞中單分子間的相互作用。這是一個長期目標。”當細胞在發(fā)育過程中或在細胞高度異質性的腫瘤中退出干細胞狀態(tài)時，單細胞數(shù)據(jù)可能有助于跟蹤DNA結合因子。

   有幾種方法正在接近這一目標。然而，“許多單細胞方法的靈敏度仍然有限。”加州大學圣地亞哥分�；蚪M生物學專家Christopher Benner說。例如，Bernstein和他的同事使用微流控系統(tǒng)和條形碼技術采集單細胞ChIP-seq數(shù)據(jù)。該技術從每個細胞中捕獲到500~10000個獨特的代表DNA結合事件的“可讀取片段”，而在細胞群中則可以捕獲到數(shù)百萬個可讀取片段。

   有幾種方法也可以產(chǎn)生基因組活躍區(qū)域的數(shù)據(jù)。ATAC-seq（基于測序的轉座酶可達染色質測定）在開放染色質區(qū)域部署一個整合到基因組的超高活性轉座酶，并引入測序適配器。ATAC-seq可適用于單個細胞，而且得到的序列數(shù)據(jù)可以用各種計算方法進行分析。例如，這些方法可以鑒定啟動子序列，或者識別實驗中的條件同時敲除DNA控制元件，又或者評估RNA表達。

   Snyder指出，ATAC-seq存在一些缺陷，例如未完全整合到可達區(qū)域。但是這項技術仍然很強大，它可以被用于插入熒光團并進行成像，從而在測序之前得到3D基因組結構的成像數(shù)據(jù)。

   Snyder表示，在斯坦福大學的Alistair Boettiger等實驗室里，成像工作正在進行，他們正在開發(fā)利用超分辨率成像技術同時成像基因元件和新生RNA轉錄本的方法，以評估哪些元件促進或抑制了基因表達。“成像是未來的趨勢。”Stamatoyannopoulos補充道。其他研究人員注意到，隨著“三代”納米孔測序技術的改進，將會開發(fā)出類似ChIP的方法來插入它。

   “我們可能需要完全正交的方法來達到這個目標。”研究單細胞染色質分析的Bernstein說，基于“某些與我們現(xiàn)在使用的完全不同的技術”，這個目標最終很可能會成功實現(xiàn)�！�

（譯者李楠系中國科學院深圳先進技術研究院副研究員）

作者Charlotte Schubert是一位常駐西雅圖的自由記者。2015~2016年，她曾經(jīng)在Steve Henikoff的實驗室里參與一些與本文所涉及內(nèi)容無關的項目研究工作。

鳴謝：“原文由美國科學促進會（www.aaas.org）發(fā)布在2018年12月16日《科學》雜志”。官方英文版請見https://www.sciencemag.org/features/2018/12/chip-old-block-beyond-chromatin-immunoprecipitation。