重新認識蛋白表達

  CRISPR/Cas9系統(tǒng)等基因組編輯工具的出現(xiàn)，為科學家提供了一種成本低廉、易于獲取、且相對簡單的改變基因的方法。通過結(jié)構(gòu)和翻譯后修飾來精確控制蛋白表達，在表達治療性蛋白（如處方藥）方面同樣十分重要。而控制其他物種（如蚊子）的蛋白質(zhì)表達，甚至可能有助于研究人員根除瘧疾、寨卡病毒和西尼羅河病毒、登革熱以及其他由蚊子傳播的疾病。

  快速發(fā)展的分子工具有著深遠的影響，CRISPR的廣泛應用已經(jīng)證明了這一點，加州大學伯克利分校分子細胞生物學和生物化學系教授Jamie Cate表示。他說:“CRISPR系統(tǒng)是神奇的資源，可以幫我們發(fā)現(xiàn)操縱RNA和DNA的新工具，我把現(xiàn)階段生物學的發(fā)展看作是計算機領域的晶體管革命。”

  其他分子工具也在發(fā)展，有時還與CRISPR系統(tǒng)相互配合，以拓寬應用范圍，增強蛋白質(zhì)表達控制的效力和多功能性。例如，人工酶正在擺脫它們的局限性，獲得可編程能力。分子開關(guān)正變得多面化，能夠進行更多的微調(diào)操作。新一代的蛋白表達系統(tǒng)可以帶來比以往任何時候都多的復雜生物療法。有一件事是肯定的，隨著分子控制手段變得越來越復雜，它們的用途也在不斷擴展。

 

靶向DNA和RNA的人工酶

 

  盡管CRISPR/Cas9是一種強大的工具，但該系統(tǒng)偶爾也有缺陷。其中一個是需要基序 （PAM）序列恰好位于預期編輯位點的上游。PAM序列是Cas9酶的結(jié)合信號，所以它的存在是必要的，但同時也是一個限制（如果在所需編輯位點的上游不存在PAM序列，則需要創(chuàng)建一個）。伊利諾伊大學厄巴納—香檳分校Carl R. Woese基因組生物學研究所生物系統(tǒng)設計研究組負責人趙惠民正在開發(fā)一種類似CRISPR的基因組編輯工具，以消除這種限制，并通過繞過PAM序列進行編輯來提高系統(tǒng)的通用性。

  趙惠民的實驗室開發(fā)了一種基于PfAgo的人工限制性內(nèi)切酶（ARE）系統(tǒng)，其中PfAgo是一種來自于原核微生物（單細胞）古火球菌的Argonaute蛋白。這個平臺超越了傳統(tǒng)的II型限制性內(nèi)切酶，即可以在預定的位點上切割DNA的 “分子剪刀”(1)。

  “我們可以很容易地創(chuàng)造無數(shù)種人工限制性內(nèi)切酶，它們具有所需的序列特異性，并產(chǎn)生確定的不同長度的粘性末端。這個簡單的系統(tǒng)由一個蛋白質(zhì)PfAgo和兩個針對特定雙鏈DNA序列的向?qū)NA組成，”趙惠民說。“這個系統(tǒng)可以多路復用，因為同一個蛋白質(zhì)可以裝載多個向?qū)NA，同時定位多個位點。”

  因為向?qū)NA指示PfAgo在哪里切割，通過編程可以使系統(tǒng)切割幾乎任何地方。另一個優(yōu)點是PfAgo的識別序列（通常是16個堿基對）比傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切酶（通常識別4到8個堿基對）更長;識別序列越長，越容易找到獨特的切割位點。與以前的人工限制性內(nèi)切酶不同，PfAgo在切割DNA時可以產(chǎn)生特定而且較長的粘性末端，這有助于隨后將DNA片段連接在一起。

  趙惠民的實驗室渴望應用這項新技術(shù)。他說:“我們還開發(fā)了一種基于PfAgo/ARE的直接克隆方法，用于克隆大型的天然產(chǎn)物生物合成基因簇，以發(fā)現(xiàn)新的天然產(chǎn)物，這些產(chǎn)物有可能被用作抗生素和抗癌藥物。”他新成立的Modular Bioscience公司將探索PfAgo在醫(yī)學診斷中的應用，如液體活檢、或者單核苷酸多態(tài)性和病原體的檢測等。

  另一種與CRISPR相關(guān)的Argonaute蛋白來自Marinitoga piezophila （MpAgo）細菌，是Cate實驗室的研究重點，該實驗室主要研究蛋白質(zhì)的翻譯機制和調(diào)控(2)。“我們的目標是制造一種RNA靶向技術(shù)，我們可以用它來探索人類細胞中的RNA生物學，” Cate說。他們想要利用RNA引導的蛋白質(zhì)來定位RNA，作為用共價鍵標記RNA的替代方法。

  Cate團隊的一名成員、博士后研究員Audrey Lapinaite發(fā)現(xiàn)，主要的挑戰(zhàn)是“如何將向?qū)NA裝入細胞內(nèi)的MpAgo”，Cate說。她解決了這個問題，在體外組裝了向?qū)NA-蛋白復合物（RNPs），然后在細胞實驗中使用RNPs。Lapinaite發(fā)現(xiàn)，對向?qū)NA的5’-核苷酸進行修飾后，可以生成易于編程的RNPs，其與完全互補的RNA靶標具有很高的親和力。此外，經(jīng)修飾的RNPs具有較高的特異性，可以區(qū)分僅有一個核苷酸差異的RNA底物。

  Cate對使用MpAgo RNPs操縱RNA的前景感到興奮。他說:“我們最希望利用MpAgo在人類細胞中定位RNA，用類似成像和蛋白質(zhì)組學實驗來探索人類RNA生物學。”因為MpAgo來源于細菌，所以它不太可能用于治療目的。但是Cate希望利用這個系統(tǒng)來深入了解內(nèi)源性的人類Argonautes是如何工作的。

 

分子開關(guān)

 

  鑒于CRISPR/Cas9基因組編輯的強大功能，研究人員正在尋找使該系統(tǒng)可誘導啟動的方法，以便在特定時間打開或關(guān)閉編輯功能。一個由卡迪夫大學的Yu-Hsuan Tsai和巴斯大學的Anthony Perry領導的英國合作團隊開發(fā)了一種新型的誘導CRISPR開關(guān)(3)。之前的開關(guān)有一系列的缺點,如在沒有信號的情況下，泄漏產(chǎn)生編輯活性，或依賴于抗生素的使用，從而增加抗生素耐藥性的風險等。“我們設想使用一種人工的、非生理的氨基酸來解決這些問題，”Tsai說。

  Tsai和Perry的研究小組利用遺傳密碼擴展技術(shù)，使基因組對人工信號敏感。在細胞系和小鼠胚胎的基因組中，研究人員插入一個擴展遺傳密碼的工具箱，該工具箱使Cas9（基因組編輯所需的酶）的表達依賴于賴氨酸衍生物Lys（Boc）的存在。這種非天然氨基酸是實現(xiàn)這一目的理想選擇，因為它便宜、安全、容易獲得，而且易于給細胞或整個動物注射。

  研究人員們發(fā)現(xiàn)，Lys（Boc）的存在可以引發(fā)基因組編輯，而Lys缺失時則沒有發(fā)生基因組編輯。Tsai和Perry設計的開關(guān)之所以成功，部分原因可能是在策略選擇上:“我們的方法控制功能蛋白Cas9的翻譯，而以前的方法則依賴于翻譯后控制，如通過不同的刺激調(diào)節(jié)翻譯出的蛋白的活性，”Tsai說。

  基因驅(qū)動器是該成果在未來的應用之一，它可以確保所有的后代都將繼承某些遺傳變化，這些變化會在動物種群中迅速傳播（例如，在畜群中）。由于效應是由誘導產(chǎn)生的，所以其力度控制更加安全。這種新的、可誘導的CRISPR開關(guān)可能更適合“在臨床治療性基因組進行原位編輯，或在環(huán)境兼容的控制中作為至關(guān)重要的基因驅(qū)動器”，Tsai說。

  另一種分子開關(guān)類型具有人造酶特性，它是由一個瑞士合作團隊開發(fā)的。這個團隊由分子系統(tǒng)工程NCCR（國家研究能力中心）的主任 Tom Ward領導，它最初是由巴塞爾大學和蘇黎世聯(lián)邦理工學院（瑞士聯(lián)邦理工學院）的研究人員啟動的一個多學科協(xié)作計劃。Ward的實驗室聯(lián)合了日內(nèi)瓦大學有機化學系的Stefan Matile實驗室和蘇黎世聯(lián)邦理工學院生物系統(tǒng)科學與工程學系的Martin Fussenegger實驗室。團隊基于他們各自在人工金屬酶、細胞穿透性和合成基因開關(guān)方面的深厚積累，采用了模塊化的設計策略。

  這種新型的可穿透細胞的二硫鍵模塊讓人造金屬酶在不傷害細胞的情況下進入細胞，Ward說，“讓人聯(lián)想到特洛伊木馬”。進入后，酶催化一種能釋放激素的反應。合成基因開關(guān)模塊檢測新釋放的激素，并通過啟動熒光指示劑——熒光素酶的表達進行響應。Ward說:“基因開關(guān)是由人造酶的非生物性的反應來開啟的。”

  現(xiàn)階段的合作已經(jīng)為他們的系統(tǒng)完成了概念驗證(4)，他們正在積極地推動生物醫(yī)學應用，包括與宿主蛋白的相互作用。例如，一種由癌細胞表達的能夠?qū)崿F(xiàn)精確定位的蛋白。“碳酸酐酶在許多癌細胞的表面過表達。” Ward說: “我們可以利用這種蛋白質(zhì)在癌細胞表面或內(nèi)部積累人工金屬酶；只有當人工金屬酶與碳酸酐酶結(jié)合時，系統(tǒng)才會啟動。”

 

新一代表達系統(tǒng)

 

  基因表達的分子調(diào)控技術(shù)的進步也為蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)的優(yōu)化提供了更多的機會。隨著藥物制造商尋找更便宜的方式來表達新的生物藥物，新一代表達系統(tǒng)的發(fā)展得到大力的推動。目前，標準的表達系統(tǒng)是來自哺乳動物的中國倉鼠卵巢（CHO）細胞系。然而，CHO細胞的局限性——如成本高和相對較慢的生長速度——使得新一代系統(tǒng)在表達新的生物藥物方面有其競爭力，尤其是在助力降低重要藥物的成本方面。

  例如，AbSci公司的SoluPro蛋白表達平臺可以在極高的滴度下生成可溶的、正確折疊的蛋白，目前可以使用大腸桿菌表達4g/L全長抗體和超過20g/L其他復雜產(chǎn)物。通常來說，一些人類蛋白不能在大腸桿菌中表達，需要哺乳動物細胞系進行正確的折疊。AbSci的技術(shù)包括兩項創(chuàng)新，這兩項創(chuàng)新使得在大腸桿菌中生產(chǎn)這種蛋白質(zhì)成為可能，同時利用了這種表達系統(tǒng)的簡單性和較低的成本。

  一個創(chuàng)新是通過半碘化的細胞質(zhì)，產(chǎn)生可溶性的、含二硫鍵連接的蛋白質(zhì)。“細胞質(zhì)生產(chǎn)通常會受到包涵體形成的限制，但其實它在其他方面是比較理想的，因為它的生產(chǎn)能力比周質(zhì)生產(chǎn)高得多，對蛋白質(zhì)大小沒有限制。與基于分泌的表達系統(tǒng)相比，它的產(chǎn)生周期顯著縮短到一兩天。”AbSci的創(chuàng)始人和首席執(zhí)行官Sean McClain說。第二個創(chuàng)新是SoluPro的雙誘導啟動子，可以獨立控制。這使它能夠“調(diào)整”蛋白質(zhì)的生產(chǎn)速率，優(yōu)化最佳的蛋白質(zhì)折疊和滴度。

  “SoluPro系統(tǒng)正確折疊蛋白質(zhì)的能力克服了傳統(tǒng)大腸桿菌表達的大部分限制，”McClain說。“我們已經(jīng)成功地制造了比較難以生產(chǎn)的新型抗體骨架，以及IgG1和IgG4分子。”許多新型抗體骨架在研發(fā)過程中獲得了越來越多的關(guān)注，但在CHO細胞中卻很難生產(chǎn)。“AbSci非常關(guān)注這些傳統(tǒng)技術(shù)難以生產(chǎn)，但是SoluPro非常適合高效生產(chǎn)的下一代抗體骨架，包括雙特異性、Fc（可結(jié)晶片段）融合蛋白和其他多特異性產(chǎn)品，”他說。

  Dyadic公司則提供了另一個新一代蛋白表達平臺，即基于真菌的C1基因表達系統(tǒng)。Dyadic公司的研發(fā)人員利用了一項偶然發(fā)現(xiàn)的突變，使絲狀耐熱菌的蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高了100倍（該公司將其命名為“C1”）。他們目前專注于生物醫(yī)學方面的推廣，將C1表達平臺應用于使生物疫苗和藥物更便宜和易于獲得。雖然絲狀真菌聽起來很奇特，但在本質(zhì)上它們是天然的分泌者（C1的倍增時間是2小時，而CHO細胞需要大約20小時）。他們還使用了合成培養(yǎng)基，這進一步降低了成本，并且避免了CHO細胞所需的病毒滅活步驟。

  據(jù)Dyadic首席執(zhí)行官Mark Emalfarb說，如今CHO細胞等細胞系生產(chǎn)生物類似藥的效率較低。Emalfarb說，“我們可以在三分之一的時間內(nèi)多生產(chǎn)2到5倍的產(chǎn)品，并且只需要花費CHO培養(yǎng)基成本的一小部分（與報道的行業(yè)CHO平均生產(chǎn)率相比）。”因為C1會將其產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，所以下游的蛋白質(zhì)收集步驟也比其他系統(tǒng)更簡單。例如，大腸桿菌需要分解細胞，從細胞組分中提純產(chǎn)物，這增加了復雜性和成本。

  Dyadic公司的C1平臺可高效生產(chǎn)全長單克隆抗體、重鏈和輕鏈抗體、fc-融合蛋白、fab（抗原結(jié)合片段）、雙特異性抗體和疫苗。Emalfarb說：“我們還可以制造VLPs（類病毒顆粒），從理論上講，這是一種更有效的疫苗，一般來說更難表達。我們現(xiàn)在甚至有一個分泌型的VLP，所以在下游處理過程中損失更少。”

  Dyadic公司還工程化改造C1以對蛋白進行不同形式的人源化糖基化，以便制藥公司對不同的糖基化蛋白進行評估。“與CHO細胞不同，C1細胞是單克隆細胞，”Dyadic首席商務官Matthew Jones解釋道。“C1有潛力產(chǎn)生更一致、更同質(zhì)的糖結(jié)構(gòu)，供公司評估，以測試哪些糖結(jié)構(gòu)可能更好用。”最近宣布與生物制藥公司賽諾菲-安萬特德國有限公司合作，將研究使用C1技術(shù)來表達不同類型的治療性分子，如疫苗和基于蛋白質(zhì)的生物制劑等。

  基于大腸桿菌和酵母的表達系統(tǒng)都有某些的優(yōu)點，比如不需要CHO細胞中昂貴的病毒清除步驟。此外，新一代表達系統(tǒng)的低成本反過來可以降低藥物價格，同時允許藥物制造商保持利潤率，這激勵制造商以更低的價格生產(chǎn)藥物并將其提供給公眾。McClain和Emalfarb都希望各自公司的技術(shù)能鼓勵制藥商銷售對社會有益，而不只是有利可圖的藥物，比如成本更低但效果更好的新型流感疫苗。

  如果沒有操控表達系統(tǒng)的遺傳學工具，這一切都不可能實現(xiàn)。隨著科學家對基因組進行更精細的控制，表達產(chǎn)物的數(shù)量將會激增。而隨著CRISPR/Cas9等基因組編輯工具的整合，新一代表達系統(tǒng)可能會達到進一步的表達水平記錄。隨著這些工具的不斷完善，對患者的益處也將不斷增加，并可能在這一過程中重塑生物醫(yī)學行業(yè)�！�

 

（譯者李楠是中國科學院深圳先進技術(shù)研究院的副研究員。）

參考文獻

1.B. Enghiad, H. Zhao, ACS Synth. Biol. 6, 752-757 (2017).

2.A. Lapinaite, J. A. Doudna, J. H. D. Cate, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115, 3368-3373 (2018). 

3.T. Suzuki et al., Sci. Rep. 8, 10051 (2018).

4.Y. Okamoto et al., Nature Comm. 9, 1943 (2018).