重新認(rèn)識(shí)蛋白表達(dá)

  CRISPR/Cas9系統(tǒng)等基因組編輯工具的出現(xiàn)，為科學(xué)家提供了一種成本低廉、易于獲取、且相對(duì)簡(jiǎn)單的改變基因的方法。通過(guò)結(jié)構(gòu)和翻譯后修飾來(lái)精確控制蛋白表達(dá)，在表達(dá)治療性蛋白（如處方藥）方面同樣十分重要。而控制其他物種（如蚊子）的蛋白質(zhì)表達(dá)，甚至可能有助于研究人員根除瘧疾、寨卡病毒和西尼羅河病毒、登革熱以及其他由蚊子傳播的疾病。

  快速發(fā)展的分子工具有著深遠(yuǎn)的影響，CRISPR的廣泛應(yīng)用已經(jīng)證明了這一點(diǎn)，加州大學(xué)伯克利分校分子細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)系教授Jamie Cate表示。他說(shuō):“CRISPR系統(tǒng)是神奇的資源，可以幫我們發(fā)現(xiàn)操縱RNA和DNA的新工具，我把現(xiàn)階段生物學(xué)的發(fā)展看作是計(jì)算機(jī)領(lǐng)域的晶體管革命。”

  其他分子工具也在發(fā)展，有時(shí)還與CRISPR系統(tǒng)相互配合，以拓寬應(yīng)用范圍，增強(qiáng)蛋白質(zhì)表達(dá)控制的效力和多功能性。例如，人工酶正在擺脫它們的局限性，獲得可編程能力。分子開關(guān)正變得多面化，能夠進(jìn)行更多的微調(diào)操作。新一代的蛋白表達(dá)系統(tǒng)可以帶來(lái)比以往任何時(shí)候都多的復(fù)雜生物療法。有一件事是肯定的，隨著分子控制手段變得越來(lái)越復(fù)雜，它們的用途也在不斷擴(kuò)展。

 

靶向DNA和RNA的人工酶

 

  盡管CRISPR/Cas9是一種強(qiáng)大的工具，但該系統(tǒng)偶爾也有缺陷。其中一個(gè)是需要基序 （PAM）序列恰好位于預(yù)期編輯位點(diǎn)的上游。PAM序列是Cas9酶的結(jié)合信號(hào)，所以它的存在是必要的，但同時(shí)也是一個(gè)限制（如果在所需編輯位點(diǎn)的上游不存在PAM序列，則需要?jiǎng)?chuàng)建一個(gè)）。伊利諾伊大學(xué)厄巴納—香檳分校Carl R. Woese基因組生物學(xué)研究所生物系統(tǒng)設(shè)計(jì)研究組負(fù)責(zé)人趙惠民正在開發(fā)一種類似CRISPR的基因組編輯工具，以消除這種限制，并通過(guò)繞過(guò)PAM序列進(jìn)行編輯來(lái)提高系統(tǒng)的通用性。

  趙惠民的實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了一種基于PfAgo的人工限制性內(nèi)切酶（ARE）系統(tǒng)，其中PfAgo是一種來(lái)自于原核微生物（單細(xì)胞）古火球菌的Argonaute蛋白。這個(gè)平臺(tái)超越了傳統(tǒng)的II型限制性內(nèi)切酶，即可以在預(yù)定的位點(diǎn)上切割DNA的 “分子剪刀”(1)。

  “我們可以很容易地創(chuàng)造無(wú)數(shù)種人工限制性內(nèi)切酶，它們具有所需的序列特異性，并產(chǎn)生確定的不同長(zhǎng)度的粘性末端。這個(gè)簡(jiǎn)單的系統(tǒng)由一個(gè)蛋白質(zhì)PfAgo和兩個(gè)針對(duì)特定雙鏈DNA序列的向?qū)NA組成，”趙惠民說(shuō)。“這個(gè)系統(tǒng)可以多路復(fù)用，因?yàn)橥粋�(gè)蛋白質(zhì)可以裝載多個(gè)向?qū)NA，同時(shí)定位多個(gè)位點(diǎn)。”

  因?yàn)橄驅(qū)NA指示PfAgo在哪里切割，通過(guò)編程可以使系統(tǒng)切割幾乎任何地方。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是PfAgo的識(shí)別序列（通常是16個(gè)堿基對(duì)）比傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切酶（通常識(shí)別4到8個(gè)堿基對(duì)）更長(zhǎng);識(shí)別序列越長(zhǎng)，越容易找到獨(dú)特的切割位點(diǎn)。與以前的人工限制性內(nèi)切酶不同，PfAgo在切割DNA時(shí)可以產(chǎn)生特定而且較長(zhǎng)的粘性末端，這有助于隨后將DNA片段連接在一起。

  趙惠民的實(shí)驗(yàn)室渴望應(yīng)用這項(xiàng)新技術(shù)。他說(shuō):“我們還開發(fā)了一種基于PfAgo/ARE的直接克隆方法，用于克隆大型的天然產(chǎn)物生物合成基因簇，以發(fā)現(xiàn)新的天然產(chǎn)物，這些產(chǎn)物有可能被用作抗生素和抗癌藥物。”他新成立的Modular Bioscience公司將探索PfAgo在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用，如液體活檢、或者單核苷酸多態(tài)性和病原體的檢測(cè)等。

  另一種與CRISPR相關(guān)的Argonaute蛋白來(lái)自Marinitoga piezophila （MpAgo）細(xì)菌，是Cate實(shí)驗(yàn)室的研究重點(diǎn)，該實(shí)驗(yàn)室主要研究蛋白質(zhì)的翻譯機(jī)制和調(diào)控(2)。“我們的目標(biāo)是制造一種RNA靶向技術(shù)，我們可以用它來(lái)探索人類細(xì)胞中的RNA生物學(xué)，” Cate說(shuō)。他們想要利用RNA引導(dǎo)的蛋白質(zhì)來(lái)定位RNA，作為用共價(jià)鍵標(biāo)記RNA的替代方法。

  Cate團(tuán)隊(duì)的一名成員、博士后研究員Audrey Lapinaite發(fā)現(xiàn)，主要的挑戰(zhàn)是“如何將向?qū)NA裝入細(xì)胞內(nèi)的MpAgo”，Cate說(shuō)。她解決了這個(gè)問題，在體外組裝了向?qū)NA-蛋白復(fù)合物（RNPs），然后在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中使用RNPs。Lapinaite發(fā)現(xiàn)，對(duì)向?qū)NA的5’-核苷酸進(jìn)行修飾后，可以生成易于編程的RNPs，其與完全互補(bǔ)的RNA靶標(biāo)具有很高的親和力。此外，經(jīng)修飾的RNPs具有較高的特異性，可以區(qū)分僅有一個(gè)核苷酸差異的RNA底物。

  Cate對(duì)使用MpAgo RNPs操縱RNA的前景感到興奮。他說(shuō):“我們最希望利用MpAgo在人類細(xì)胞中定位RNA，用類似成像和蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)探索人類RNA生物學(xué)。”因?yàn)镸pAgo來(lái)源于細(xì)菌，所以它不太可能用于治療目的。但是Cate希望利用這個(gè)系統(tǒng)來(lái)深入了解內(nèi)源性的人類Argonautes是如何工作的。

 

分子開關(guān)

 

  鑒于CRISPR/Cas9基因組編輯的強(qiáng)大功能，研究人員正在尋找使該系統(tǒng)可誘導(dǎo)啟動(dòng)的方法，以便在特定時(shí)間打開或關(guān)閉編輯功能。一個(gè)由卡迪夫大學(xué)的Yu-Hsuan Tsai和巴斯大學(xué)的Anthony Perry領(lǐng)導(dǎo)的英國(guó)合作團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種新型的誘導(dǎo)CRISPR開關(guān)(3)。之前的開關(guān)有一系列的缺點(diǎn),如在沒有信號(hào)的情況下，泄漏產(chǎn)生編輯活性，或依賴于抗生素的使用，從而增加抗生素耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)等。“我們?cè)O(shè)想使用一種人工的、非生理的氨基酸來(lái)解決這些問題，”Tsai說(shuō)。

  Tsai和Perry的研究小組利用遺傳密碼擴(kuò)展技術(shù)，使基因組對(duì)人工信號(hào)敏感。在細(xì)胞系和小鼠胚胎的基因組中，研究人員插入一個(gè)擴(kuò)展遺傳密碼的工具箱，該工具箱使Cas9（基因組編輯所需的酶）的表達(dá)依賴于賴氨酸衍生物L(fēng)ys（Boc）的存在。這種非天然氨基酸是實(shí)現(xiàn)這一目的理想選擇，因?yàn)樗阋�、安全、容易獲得，而且易于給細(xì)胞或整個(gè)動(dòng)物注射。

  研究人員們發(fā)現(xiàn)，Lys（Boc）的存在可以引發(fā)基因組編輯，而Lys缺失時(shí)則沒有發(fā)生基因組編輯。Tsai和Perry設(shè)計(jì)的開關(guān)之所以成功，部分原因可能是在策略選擇上:“我們的方法控制功能蛋白Cas9的翻譯，而以前的方法則依賴于翻譯后控制，如通過(guò)不同的刺激調(diào)節(jié)翻譯出的蛋白的活性，”Tsai說(shuō)。

  基因驅(qū)動(dòng)器是該成果在未來(lái)的應(yīng)用之一，它可以確保所有的后代都將繼承某些遺傳變化，這些變化會(huì)在動(dòng)物種群中迅速傳播（例如，在畜群中）。由于效應(yīng)是由誘導(dǎo)產(chǎn)生的，所以其力度控制更加安全。這種新的、可誘導(dǎo)的CRISPR開關(guān)可能更適合“在臨床治療性基因組進(jìn)行原位編輯，或在環(huán)境兼容的控制中作為至關(guān)重要的基因驅(qū)動(dòng)器”，Tsai說(shuō)。

  另一種分子開關(guān)類型具有人造酶特性，它是由一個(gè)瑞士合作團(tuán)隊(duì)開發(fā)的。這個(gè)團(tuán)隊(duì)由分子系統(tǒng)工程N(yùn)CCR（國(guó)家研究能力中心）的主任 Tom Ward領(lǐng)導(dǎo)，它最初是由巴塞爾大學(xué)和蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院（瑞士聯(lián)邦理工學(xué)院）的研究人員啟動(dòng)的一個(gè)多學(xué)科協(xié)作計(jì)劃。Ward的實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合了日內(nèi)瓦大學(xué)有機(jī)化學(xué)系的Stefan Matile實(shí)驗(yàn)室和蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院生物系統(tǒng)科學(xué)與工程學(xué)系的Martin Fussenegger實(shí)驗(yàn)室。團(tuán)隊(duì)基于他們各自在人工金屬酶、細(xì)胞穿透性和合成基因開關(guān)方面的深厚積累，采用了模塊化的設(shè)計(jì)策略。

  這種新型的可穿透細(xì)胞的二硫鍵模塊讓人造金屬酶在不傷害細(xì)胞的情況下進(jìn)入細(xì)胞，Ward說(shuō)，“讓人聯(lián)想到特洛伊木馬”。進(jìn)入后，酶催化一種能釋放激素的反應(yīng)。合成基因開關(guān)模塊檢測(cè)新釋放的激素，并通過(guò)啟動(dòng)熒光指示劑——熒光素酶的表達(dá)進(jìn)行響應(yīng)。Ward說(shuō):“基因開關(guān)是由人造酶的非生物性的反應(yīng)來(lái)開啟的。”

  現(xiàn)階段的合作已經(jīng)為他們的系統(tǒng)完成了概念驗(yàn)證(4)，他們正在積極地推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，包括與宿主蛋白的相互作用。例如，一種由癌細(xì)胞表達(dá)的能夠?qū)崿F(xiàn)精確定位的蛋白。“碳酸酐酶在許多癌細(xì)胞的表面過(guò)表達(dá)。” Ward說(shuō): “我們可以利用這種蛋白質(zhì)在癌細(xì)胞表面或內(nèi)部積累人工金屬酶；只有當(dāng)人工金屬酶與碳酸酐酶結(jié)合時(shí)，系統(tǒng)才會(huì)啟動(dòng)。”

 

新一代表達(dá)系統(tǒng)

 

  基因表達(dá)的分子調(diào)控技術(shù)的進(jìn)步也為蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化提供了更多的機(jī)會(huì)。隨著藥物制造商尋找更便宜的方式來(lái)表達(dá)新的生物藥物，新一代表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展得到大力的推動(dòng)。目前，標(biāo)準(zhǔn)的表達(dá)系統(tǒng)是來(lái)自哺乳動(dòng)物的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞系。然而，CHO細(xì)胞的局限性——如成本高和相對(duì)較慢的生長(zhǎng)速度——使得新一代系統(tǒng)在表達(dá)新的生物藥物方面有其競(jìng)爭(zhēng)力，尤其是在助力降低重要藥物的成本方面。

  例如，AbSci公司的SoluPro蛋白表達(dá)平臺(tái)可以在極高的滴度下生成可溶的、正確折疊的蛋白，目前可以使用大腸桿菌表達(dá)4g/L全長(zhǎng)抗體和超過(guò)20g/L其他復(fù)雜產(chǎn)物。通常來(lái)說(shuō)，一些人類蛋白不能在大腸桿菌中表達(dá)，需要哺乳動(dòng)物細(xì)胞系進(jìn)行正確的折疊。AbSci的技術(shù)包括兩項(xiàng)創(chuàng)新，這兩項(xiàng)創(chuàng)新使得在大腸桿菌中生產(chǎn)這種蛋白質(zhì)成為可能，同時(shí)利用了這種表達(dá)系統(tǒng)的簡(jiǎn)單性和較低的成本。

  一個(gè)創(chuàng)新是通過(guò)半碘化的細(xì)胞質(zhì)，產(chǎn)生可溶性的、含二硫鍵連接的蛋白質(zhì)。“細(xì)胞質(zhì)生產(chǎn)通常會(huì)受到包涵體形成的限制，但其實(shí)它在其他方面是比較理想的，因?yàn)樗纳a(chǎn)能力比周質(zhì)生產(chǎn)高得多，對(duì)蛋白質(zhì)大小沒有限制。與基于分泌的表達(dá)系統(tǒng)相比，它的產(chǎn)生周期顯著縮短到一兩天。”AbSci的創(chuàng)始人和首席執(zhí)行官Sean McClain說(shuō)。第二個(gè)創(chuàng)新是SoluPro的雙誘導(dǎo)啟動(dòng)子，可以獨(dú)立控制。這使它能夠“調(diào)整”蛋白質(zhì)的生產(chǎn)速率，優(yōu)化最佳的蛋白質(zhì)折疊和滴度。

  “SoluPro系統(tǒng)正確折疊蛋白質(zhì)的能力克服了傳統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)的大部分限制，”McClain說(shuō)。“我們已經(jīng)成功地制造了比較難以生產(chǎn)的新型抗體骨架，以及IgG1和IgG4分子。”許多新型抗體骨架在研發(fā)過(guò)程中獲得了越來(lái)越多的關(guān)注，但在CHO細(xì)胞中卻很難生產(chǎn)。“AbSci非常關(guān)注這些傳統(tǒng)技術(shù)難以生產(chǎn)，但是SoluPro非常適合高效生產(chǎn)的下一代抗體骨架，包括雙特異性、Fc（可結(jié)晶片段）融合蛋白和其他多特異性產(chǎn)品，”他說(shuō)。

  Dyadic公司則提供了另一個(gè)新一代蛋白表達(dá)平臺(tái)，即基于真菌的C1基因表達(dá)系統(tǒng)。Dyadic公司的研發(fā)人員利用了一項(xiàng)偶然發(fā)現(xiàn)的突變，使絲狀耐熱菌的蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高了100倍（該公司將其命名為“C1”）。他們目前專注于生物醫(yī)學(xué)方面的推廣，將C1表達(dá)平臺(tái)應(yīng)用于使生物疫苗和藥物更便宜和易于獲得。雖然絲狀真菌聽起來(lái)很奇特，但在本質(zhì)上它們是天然的分泌者（C1的倍增時(shí)間是2小時(shí)，而CHO細(xì)胞需要大約20小時(shí)）。他們還使用了合成培養(yǎng)基，這進(jìn)一步降低了成本，并且避免了CHO細(xì)胞所需的病毒滅活步驟。

  據(jù)Dyadic首席執(zhí)行官M(fèi)ark Emalfarb說(shuō)，如今CHO細(xì)胞等細(xì)胞系生產(chǎn)生物類似藥的效率較低。Emalfarb說(shuō)，“我們可以在三分之一的時(shí)間內(nèi)多生產(chǎn)2到5倍的產(chǎn)品，并且只需要花費(fèi)CHO培養(yǎng)基成本的一小部分（與報(bào)道的行業(yè)CHO平均生產(chǎn)率相比）。”因?yàn)镃1會(huì)將其產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，所以下游的蛋白質(zhì)收集步驟也比其他系統(tǒng)更簡(jiǎn)單。例如，大腸桿菌需要分解細(xì)胞，從細(xì)胞組分中提純產(chǎn)物，這增加了復(fù)雜性和成本。

  Dyadic公司的C1平臺(tái)可高效生產(chǎn)全長(zhǎng)單克隆抗體、重鏈和輕鏈抗體、fc-融合蛋白、fab（抗原結(jié)合片段）、雙特異性抗體和疫苗。Emalfarb說(shuō)：“我們還可以制造VLPs（類病毒顆粒），從理論上講，這是一種更有效的疫苗，一般來(lái)說(shuō)更難表達(dá)。我們現(xiàn)在甚至有一個(gè)分泌型的VLP，所以在下游處理過(guò)程中損失更少。”

  Dyadic公司還工程化改造C1以對(duì)蛋白進(jìn)行不同形式的人源化糖基化，以便制藥公司對(duì)不同的糖基化蛋白進(jìn)行評(píng)估。“與CHO細(xì)胞不同，C1細(xì)胞是單克隆細(xì)胞，”Dyadic首席商務(wù)官M(fèi)atthew Jones解釋道。“C1有潛力產(chǎn)生更一致、更同質(zhì)的糖結(jié)構(gòu)，供公司評(píng)估，以測(cè)試哪些糖結(jié)構(gòu)可能更好用。”最近宣布與生物制藥公司賽諾菲-安萬(wàn)特德國(guó)有限公司合作，將研究使用C1技術(shù)來(lái)表達(dá)不同類型的治療性分子，如疫苗和基于蛋白質(zhì)的生物制劑等。

  基于大腸桿菌和酵母的表達(dá)系統(tǒng)都有某些的優(yōu)點(diǎn)，比如不需要CHO細(xì)胞中昂貴的病毒清除步驟。此外，新一代表達(dá)系統(tǒng)的低成本反過(guò)來(lái)可以降低藥物價(jià)格，同時(shí)允許藥物制造商保持利潤(rùn)率，這激勵(lì)制造商以更低的價(jià)格生產(chǎn)藥物并將其提供給公眾。McClain和Emalfarb都希望各自公司的技術(shù)能鼓勵(lì)制藥商銷售對(duì)社會(huì)有益，而不只是有利可圖的藥物，比如成本更低但效果更好的新型流感疫苗。

  如果沒有操控表達(dá)系統(tǒng)的遺傳學(xué)工具，這一切都不可能實(shí)現(xiàn)。隨著科學(xué)家對(duì)基因組進(jìn)行更精細(xì)的控制，表達(dá)產(chǎn)物的數(shù)量將會(huì)激增。而隨著CRISPR/Cas9等基因組編輯工具的整合，新一代表達(dá)系統(tǒng)可能會(huì)達(dá)到進(jìn)一步的表達(dá)水平記錄。隨著這些工具的不斷完善，對(duì)患者的益處也將不斷增加，并可能在這一過(guò)程中重塑生物醫(yī)學(xué)行業(yè)�！�

 

（譯者李楠是中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院的副研究員。）

參考文獻(xiàn)

1.B. Enghiad, H. Zhao, ACS Synth. Biol. 6, 752-757 (2017).

2.A. Lapinaite, J. A. Doudna, J. H. D. Cate, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115, 3368-3373 (2018). 

3.T. Suzuki et al., Sci. Rep. 8, 10051 (2018).

4.Y. Okamoto et al., Nature Comm. 9, 1943 (2018).