六年前，負(fù)責(zé)為Ping Yeh治療的腫瘤科醫(yī)生告訴他，他的霍奇金淋巴瘤對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的化療方案有耐藥性，他需要一種更有效的七藥雞尾酒療法。這種治療使他的癌癥得到了緩解，但之后Yeh需要進(jìn)行超聲波檢查，看看這種治療是否損害了他的心臟（該療法對(duì)于部分患者是有心臟毒性的）。
“這種治療的確治愈了我，但它也可能在治愈我的同時(shí)殺死我。”Yeh解釋說(shuō)，這是一次非�？膳碌慕�(jīng)歷，它讓我思考是否有更好的方法來(lái)檢測(cè)藥物安全性。2014年，Yeh在明尼阿波利斯與人合作創(chuàng)辦了StemoniX公司，目的是將工程、制造和人體干細(xì)胞方面的進(jìn)展結(jié)合起來(lái)，開(kāi)發(fā)與人體生理學(xué)更具相似性的藥物篩選和測(cè)試平臺(tái)。
幸運(yùn)的是，Yeh的心臟有驚無(wú)險(xiǎn)。不幸的是，像Yeh這樣的病人經(jīng)常遇到有毒或無(wú)效的藥物，因?yàn)樵谒幬镞M(jìn)入病人體內(nèi)之前用于測(cè)試藥物的動(dòng)物模型在很多方面都是不完美的。在所有進(jìn)入臨床試驗(yàn)的藥物中，只有大約10%最終獲得批準(zhǔn)(1)，其余90%的藥物在試驗(yàn)中失敗——原因包括藥物脫靶、不良反應(yīng)和劑量問(wèn)題、低效或無(wú)效，以及最糟糕的情況“毒性”。
“你越是可以更好地模擬人體的情況，就越是可以更好地的研究和理解疾病的基本病理，同時(shí)也能更好地預(yù)測(cè)藥物的療效和毒性,” Richard Eglen說(shuō)。他是位于馬薩諸塞州波士頓的康寧生命科學(xué)的副總裁兼總經(jīng)理。
然而，現(xiàn)在面臨的挑戰(zhàn)是研究人員們需要設(shè)計(jì)出比當(dāng)前策略具有顯著優(yōu)勢(shì)的模型。這意味著要建立能夠提供可靠、可重復(fù)數(shù)據(jù)的模型，同時(shí)在生物學(xué)上能幫助預(yù)測(cè)人體試驗(yàn)的效果，而且不會(huì)大幅增加成本。StemoniX、康寧和其他幾家公司正在嘗試用創(chuàng)新的方法來(lái)應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)。
細(xì)胞培養(yǎng)的高級(jí)結(jié)構(gòu)
培養(yǎng)方法不斷改進(jìn)，現(xiàn)在已經(jīng)產(chǎn)生了三維細(xì)胞培養(yǎng)、球狀體，甚至更復(fù)雜的類器官，能更準(zhǔn)確地模擬人體組織。康寧公司率先為研究人員提供了培養(yǎng)這些細(xì)胞的最好表面材料�，F(xiàn)在，該公司推出了1536孔的球狀體板，可以配合最高水平的自動(dòng)化篩選平臺(tái)工作。底部為圓形的孔，其內(nèi)壁涂有一層超低的附著表面，促使孔內(nèi)的細(xì)胞相互聚集，形成球狀體。
“這將使研究人員能夠進(jìn)行超高通量篩選，每天可篩選多達(dá)10萬(wàn)種化合物，”Eglen說(shuō)。這些板具有很小的孔體積，因此產(chǎn)生微小的球狀體，范圍從500到2000個(gè)細(xì)胞。它們提供與細(xì)胞數(shù)量成線性關(guān)系的可重復(fù)響應(yīng)。
位于加州拉荷亞的斯克里普斯研究所的一個(gè)課題組已經(jīng)在使用帶有胰腺腫瘤球狀體的平板，來(lái)識(shí)別這些細(xì)胞RAS致癌突變基因的抑制劑。以二維細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的平行篩選并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相同的抑制劑(2)�？祵幾约旱难芯渴褂萌祟惛吻驙铙w對(duì)已知的肝毒素進(jìn)行篩選，結(jié)果表明它們可以用于篩選肝臟毒性化合物。Eglen說(shuō)：“每個(gè)人都希望在給病人用藥之前能夠更好地預(yù)測(cè)藥物的代謝情況。”
康寧公司還開(kāi)發(fā)了另一項(xiàng)技術(shù)來(lái)支持間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的三維培養(yǎng)。研究人員希望將MSCs（也稱為成人干細(xì)胞）開(kāi)發(fā)成個(gè)性化的、基于患者細(xì)胞的治療方法，例如替換糖尿病中有缺陷的、用于產(chǎn)生胰島素的胰島細(xì)胞等。但是在原有條件下培養(yǎng)出足夠的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)，并將細(xì)胞送回病人體內(nèi)是一個(gè)挑戰(zhàn)�？祵幑镜囊紫⑤d體技術(shù)使用惰性，非動(dòng)物來(lái)源的聚合物制造微載體表面，從而使細(xì)胞以三維形態(tài)在這些位于培養(yǎng)液中的表面上生長(zhǎng)。然后，通過(guò)添加酶，微載體可以被溶解，只留下MSCs以便進(jìn)行分離。
人體細(xì)胞量產(chǎn)
StemoniX提供成品化的二維微心臟和微腦板，以及微腦三維球狀體板，用于高通量篩選，以提供精確的人體組織反應(yīng)測(cè)試。該公司選擇將重點(diǎn)放在腦和心臟細(xì)胞上，部分原因是神經(jīng)毒性和心臟毒性是藥物在臨床試驗(yàn)中安全性失敗的兩個(gè)最主要原因。
微心臟中的細(xì)胞沿著微通道生長(zhǎng)，形成類似于心臟肌肉的肉瘤單元結(jié)構(gòu)，具有完整的物理標(biāo)記、可形成正確的離子通道，并進(jìn)行單向收縮。
二維和三維微腦中的細(xì)胞是星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的混合物，它們形成突觸和基本的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。二維培養(yǎng)是測(cè)量細(xì)胞形態(tài)變化的關(guān)鍵，比如神經(jīng)投射。三維球狀體培養(yǎng)很難可視化，但它們表現(xiàn)出自發(fā)的、同步的神經(jīng)放電，可以定量篩選影響放電的藥物反應(yīng)。同樣，心肌細(xì)胞的收縮也可以定量測(cè)定藥物反應(yīng)，如心律失常。
“沒(méi)有一個(gè)模型是完美的，”Yeh承認(rèn)，但是他發(fā)現(xiàn)StemoniX的心臟和腦模型非常有用，“因?yàn)樗鼈兪侨祟惣?xì)胞，結(jié)構(gòu)正確，容易測(cè)量，并且以轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一小部分成本提供更具預(yù)測(cè)性、更可靠和可重復(fù)的數(shù)據(jù)。”
微環(huán)境模擬
微圖案允許研究人員通過(guò)控制特定圖案或梯度下的信號(hào)分子，或生長(zhǎng)因子來(lái)增加細(xì)胞培養(yǎng)的復(fù)雜性，但與在完整的動(dòng)物模型中相比，這種方法對(duì)信號(hào)的影響更加容易控制。
雖然微圖案技術(shù)已經(jīng)可以用于二維細(xì)胞培養(yǎng)，但目前的技術(shù)在設(shè)計(jì)梯度或分層兩個(gè)以上蛋白質(zhì)方面還很粗糙。其中一種技術(shù)是微接觸打印，它使用浸在蛋白質(zhì)溶液中的微型印章將蛋白印在培養(yǎng)物表面上，但在打印特定數(shù)量或排列方式的蛋白質(zhì)時(shí)不夠精確。為了解決這些局限，法國(guó)國(guó)家科學(xué)研究中心（CNRS）的三位研究人員想出了PRIMO，一種用于微圖案的非接觸式、無(wú)掩模技術(shù)，并建立了Alvéole公司。
PRIMO是基于光誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子吸附技術(shù)（LIMAP），并結(jié)合了一個(gè)UV照明系統(tǒng)和光活性試劑。PRIMO的機(jī)箱可以附在倒置顯微鏡上，它包含一個(gè)紫外激光器和微鏡放映機(jī)。通過(guò)顯微鏡的物鏡，計(jì)算機(jī)里的任何圖像文件都可以被它以1.2微米的分辨率投影到細(xì)胞培養(yǎng)板的表面上。
載玻片、蓋玻片、塑料板、水凝膠等均可先用聚乙二醇（PEG）作為防污劑處理，然后在溶液中加入PLPP光引發(fā)劑。當(dāng)與選擇投影圖案中的紫外線相遇時(shí)，PLPP會(huì)降解聚乙二醇，留下一個(gè)“凹槽”，由選擇的蛋白質(zhì)填充。PRIMO的Leonardo軟件可以控制顯微鏡電動(dòng)載物臺(tái)的移動(dòng)，從而調(diào)整或切換圖案。此外，使用該軟件的256灰度級(jí)來(lái)改變紫外線強(qiáng)度讓研究人員能夠控制多少PEG被降解，從而控制多少蛋白質(zhì)附著在表面。
在三維應(yīng)用中，覆蓋在涂膜上的蛋白質(zhì)微圖案可以轉(zhuǎn)移到水凝膠的表面，因?yàn)橹苯佑米贤饩�照射水凝膠可以改變其硬度。研究人員還使用PRIMO涂覆在聚二甲基硅氧烷聚合物微球的底部和側(cè)面，以特定的三維結(jié)構(gòu)培養(yǎng)肝細(xì)胞。另一個(gè)課題組還使用PRIMO將人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs）培養(yǎng)成星形膠質(zhì)細(xì)胞，并沿著細(xì)長(zhǎng)的直線排列，以測(cè)量患有神經(jīng)退行性疾病Rett綜合征患者的微管生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)(3)。
“使用PRIMO，我們可以幫助研究團(tuán)隊(duì)在短短幾周內(nèi)嘗試獲得不同形狀和寬度的線條——而使用其他微圖案技術(shù)則需要幾個(gè)月的時(shí)間，”巴黎Alvéole公司的運(yùn)營(yíng)營(yíng)銷經(jīng)理Marie-Charlotte Manus說(shuō)。
Manus說(shuō)，這一系統(tǒng)還不能很好地用于高通量成像或篩選，盡管該公司正在開(kāi)發(fā)一種用于多孔板的版本。目前，研究人員可以利用PRIMO更好的模擬體內(nèi)微環(huán)境，即通過(guò)優(yōu)化他們中細(xì)胞培養(yǎng)中遇到的微圖形。
更精確的CRISPR模型
基因編輯技術(shù)將人類細(xì)胞培養(yǎng)帶到了一個(gè)全新的基因操作水平上，無(wú)論是對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、病人來(lái)源的原代細(xì)胞，還是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。雖然科研領(lǐng)域從倫理上無(wú)法接受制造基因敲除的人類，但像CRISPR/Cas9這樣的技術(shù)可以讓研究人員快速的從培養(yǎng)的人類細(xì)胞中敲除特定基因，然后篩選所需的特性。
“在后基因組時(shí)代，我們可以用以前從未想過(guò)的方式來(lái)審視生物系統(tǒng)，”英國(guó)劍橋Horizon Discovery公司的功能基因組篩查部門(mén)負(fù)責(zé)人Benedict Cross說(shuō)。“從整個(gè)基因組的角度來(lái)看，系統(tǒng)方法很難在整個(gè)動(dòng)物中合理控制。”
Horizon Discovery的CRISPR基因敲除篩選平臺(tái)可以敲除人類細(xì)胞群體中與特定過(guò)程（如凋亡）相關(guān)的每一個(gè)基因或一系列基因，然后測(cè)量這些被改變的細(xì)胞對(duì)藥物化合物的反應(yīng)。它可用于識(shí)別新的藥物靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)與藥物敏感性或耐藥性相關(guān)的基因，或選擇最適合進(jìn)行臨床試驗(yàn)的患者。
每一個(gè)CRISPR敲除引導(dǎo)RNA都針對(duì)它敲除的基因編碼了一個(gè)獨(dú)特的條形碼，所有的細(xì)胞都作為敲除的混合種群保存在一起，無(wú)論它們是在二維單層、三維球狀體中，還是懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。一組細(xì)胞接受實(shí)驗(yàn)性治療，如藥物，另一組作為對(duì)照。處理后的細(xì)胞被分離出來(lái)，并對(duì)其條形碼進(jìn)行測(cè)序，以揭示其缺失的基因。
“在這一點(diǎn)上，它是相當(dāng)精確和定量的，”Cross說(shuō)�；驐l形碼的頻率越高，該基因的抑制作用就越有可能導(dǎo)致所需的生物活性。“這是一個(gè)全基因組水平分析的表型篩選。”
Horizon還調(diào)整了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，創(chuàng)建了另外兩個(gè)篩選平臺(tái)：CRISPR干涉（CRISPRi）和CRISPR活化（CRISPRa）。CRISPRi降低了基因表達(dá)水平，但沒(méi)有完全清除，而CRISPRa提高了目標(biāo)基因的表達(dá)。
這三個(gè)CRISPR篩選平臺(tái)可以同時(shí)用于研究相同基因的敲除、功能喪失和功能獲得。Cross說(shuō)：“當(dāng)你能夠從兩個(gè)方向觀察，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性激活和抑制某個(gè)通路的基因時(shí)，研究一個(gè)生物過(guò)程的能力就會(huì)得到極大的提高。”
基因編輯動(dòng)物
通過(guò)2014年收購(gòu)Sigma Advanced Genetic Engineering（SAGE）公司， Horizon Discovery還利用CRISPR技術(shù)，制作改良的“人源化”大鼠模型，用于藥物發(fā)現(xiàn)和安全測(cè)試。
正如位于密蘇里州圣路易斯市的Horizon Discovery體內(nèi)研發(fā)小組的負(fù)責(zé)人Kevin Forbes所解釋的那樣，小鼠模型在藥物研發(fā)領(lǐng)域的崛起，與利用胚胎干細(xì)胞（ESC）技術(shù)進(jìn)行基因敲除的易得性有關(guān)。然而，在此之前，大鼠是首選的模型，因?yàn)樗鼈兏蟮捏w積允許多次抽血和更長(zhǎng)期的化合物研究，而且它們的親社會(huì)行為和較慢的新陳代謝在生物學(xué)上更接近人類。
Horizon Discovery現(xiàn)在可以制作定制化的基因編輯大鼠、小鼠和兔子模型，修改范圍從小的點(diǎn)突變到大的片段缺失，包括敲出—敲入模型，在這個(gè)模型中，動(dòng)物基因被人類基因取代。Horizon Discovery還擁有成品化的敲除大鼠模型，用于毒理學(xué)、腫瘤學(xué)和心血管疾病研究，以及研究神經(jīng)疾病(包括自閉癥、帕金森病和阿爾茨海默病)的模型。
一個(gè)大鼠模型可以用來(lái)做藥物吸收、分配、代謝、排泄和毒理學(xué)（ADME/Tox）的研究，因?yàn)樗?jīng)過(guò)基因編輯去除了大鼠三種核受體PXR、CAR、AHR和主要的藥物代謝酶細(xì)胞色素P450 CA4。這些受體起著異種感受器的作用，啟動(dòng)細(xì)胞色素P450基因來(lái)代謝“外來(lái)”藥物。在這些ADME/Tox大鼠中，這四個(gè)基因的人類版本被重新編入。從理論上講，這些老鼠應(yīng)該像人類小腸和肝細(xì)胞檢測(cè)藥物，以啟動(dòng)代謝一樣發(fā)現(xiàn)新的藥物。
Forbes將CRISPR/Cas9描述為一種更高效、更快速的方法。與基于ESC技術(shù)的轉(zhuǎn)基因方法相比，在制造復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因模型(如ADME/Tox大鼠)方面，估計(jì)CRISPR可使這一過(guò)程縮短一年。
這些“人源化”的大鼠將很快為臨床前藥物安全測(cè)試提供一個(gè)全動(dòng)物解決方案，這比在體外用人類肝細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試要有用得多。例如，培養(yǎng)的細(xì)胞不會(huì)獲得身體其他部位形成的腫瘤，也不會(huì)發(fā)生藥物引起的心臟或認(rèn)知問(wèn)題。
當(dāng)然，藥物開(kāi)發(fā)可能永遠(yuǎn)無(wú)法脫離對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用，因?yàn)樗鼈兇砹送暾鞴傧到y(tǒng)的生物復(fù)雜性，Yeh提醒道。但這些新技術(shù)將大大減少未來(lái)藥物測(cè)試所需動(dòng)物的數(shù)量和種類。
隨著模型在“人源化”方面的改進(jìn)，藥物開(kāi)發(fā)人員應(yīng)該能夠更好地預(yù)測(cè)化合物在人體中的作用，從而避免許多候選藥物注定面臨的失敗，并避免像Yeh這樣的患者受到傷害。受他最近一次幸免于難的啟發(fā)，他一直致力于建立更好的藥物測(cè)試模型：“如果一個(gè)模型有足夠的正確部分，并且連接正確，那么我們將繼續(xù)改進(jìn)其功能。”■
參考文獻(xiàn)
1. M. Hay et al., Nat. Biotech. 32, 40-51 (2014).
2. S. Kota et al., Oncogene 37, 4372-4384 (2018); doi: 10.1038/s41388-018-0257-5.
3. C. Delépine et al., Hum. Mol. Genetics. 25, 146-157 (2016); doi: 10.1093/hmg/ddv464.
（譯者李楠是中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院的副研究員。）
作者Kendall Powell是常駐科羅拉多州拉法葉的自由科學(xué)作家。
鳴謝：“原文由美國(guó)科學(xué)促進(jìn)會(huì)（www.aaas.org）發(fā)布在2018年10月12日《科學(xué)》雜志”。官方英文版請(qǐng)見(jiàn)https://www.sciencemag.org/features/2018/10/replacing-replacements-animal-model-alternatives。