2018年11月，國際權威學術期刊《自然—方法學》刊登了一篇來自美國著名生物醫(yī)學成像專家、2010年美國青年科學家與工程師總統(tǒng)獎獲得者Hari Shroff教授的綜述文章。
在文章中，Shroff通過圖文表明，“海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡是最靈敏的結(jié)構(gòu)光超分辨率顯微鏡。與一般的結(jié)構(gòu)光超分辨率顯微鏡相比，其靈敏度高10倍以上，連續(xù)成像的張數(shù)也至少高一個數(shù)量級，因此能觀察到線粒體分裂時的內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)變化”。
得到Shroff高度贊譽的“海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡”其實出自中國科學家之手。
2018年，北京大學陳良怡團隊聯(lián)合華中科技大學譚山團隊發(fā)表于《自然—生物技術》的這一研究成果，成功將光學顯微鏡的性能提升到了一個新的高度。
更靈敏 更清楚
細胞孕育著生命的本源，構(gòu)成了生命的最基本單元。在顯微鏡發(fā)明之前，人類對細胞的認識如同在黑夜中視物。光學顯微鏡的出現(xiàn)，讓人類第一次得以看清細胞內(nèi)豐富多彩的結(jié)構(gòu)。
“生命是世界上最復雜的物質(zhì)運動形式，只有看見了生命運動的過程和疾病發(fā)生的原因，才能更有針對性、更有效地去治療這些疾病。因此，生物影像科技的發(fā)展將改變生物醫(yī)學和每個人的未來。”北京大學分子醫(yī)學研究所研究員陳良怡告訴《科學新聞》。
自誕生至今，顯微鏡在300年間經(jīng)歷了多代迭代：從最初的光學顯微鏡到共聚焦顯微鏡，再到21世紀初的超高分辨顯微鏡……探索從未止步。
陳良怡及其團隊研發(fā)出的這款海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡堪稱是目前世界上活細胞成像時間最長、時間分辨率最高的超高分辨率顯微鏡，它適用于各種細胞、不同探針的熒光成像。
分辨率通常被認作是光學顯微鏡的生命，而海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡可謂將這一點做到了“極致”。在每秒鐘得到188張超高分辨率圖像時，海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡的空間分辨率可達85納米，即能夠分辨單根頭發(fā)的1/600~1/800大小結(jié)構(gòu)，而其所需要的光照度卻小于常用的共聚焦顯微鏡光照度3個數(shù)量級。
也許通過對比更能清晰地顯示出海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡的卓越性能。
比如，在觀察細胞內(nèi)囊泡與細胞質(zhì)膜融合釋放神經(jīng)遞質(zhì)和激素這一過程時，雖然海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡與2014年摘得諾貝爾化學獎桂冠的STED顯微鏡均可以觀察到囊泡融合形成的孔道，但是前者在此基礎上，還進一步解析出了囊泡融合時的4個不同中間態(tài)：包括囊泡打開3納米小孔、囊泡塌陷、融合孔道維持以及最后的囊泡與細胞質(zhì)膜完全融合，可謂真正實現(xiàn)了膜孔道形成全過程的可視化。
為什么能看得如此清楚？“它是基于一款鏡口率為1.7的物鏡來實現(xiàn)的。這款物鏡有兩個好處，第一是它能以最大的鏡口率去照明樣本，從而獲取更高的分辨率；第二是它可以以更大的角度接收熒光，從而獲得最大的對比度。”北京大學博士后黃小帥解釋說。
有了完美的物鏡還不夠，研究團隊還需要一款與之相匹配的高折射率玻片。雖然目前國際上有一款藍寶石玻片能夠滿足需求，但其價格卻讓人望而卻步。
“這種玻片大約50美金1片，如果一天做10片細胞就需要500美金。”黃小帥告訴《科學新聞》。于是，研究團隊基于硬件自主設計出了一款玻片，其性能完全可以比美藍寶石玻片，而成本卻只有后者的十分之一。
在實現(xiàn)超高分辨的同時，海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡的超高成像速度也被業(yè)內(nèi)津津樂道——它能實現(xiàn)每秒采集1692張原始圖像，而傳統(tǒng)的顯微鏡只能達到視頻級的成像速度。
之所以能夠做到這一點，其中一個重要原因在于研究者們不斷地嘗試優(yōu)化和逼近控制系統(tǒng)的極限。“我們的同步精度可達50納秒，基于自主設計的新偏振旋轉(zhuǎn)玻片陣列以及高精度的時序控制程序，通過每9張原始圖像就能得到1張高分辨的成像，從而實現(xiàn)188Hz時間分辨率的超分辨成像；通過每次變換3張圖像滾動重構(gòu)，可以實現(xiàn)每秒564Hz的超分辨率重構(gòu)幀率。”北京大學博士研究生吳潤龍介紹。
捕捉動態(tài)過程
在超高分辨率和成像速度之外，海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡的低光毒性也非常出眾，這使得它能夠適用于細胞內(nèi)的各種細胞器研究，尤其是那些對激光強度敏感的細胞器如線粒體。
“對于光學顯微鏡而言，空間分辨率比結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡更高的超分辨成像技術如STED，需要更多的光子數(shù)也就是更高的激光強度。而線粒體受到強激光會產(chǎn)生過多的活性氧，從而導致內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞，不利于超分辨的成像。”北京大學博士研究生李柳菊告訴記者。
相比之下，海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡對于線粒體嵴的成像結(jié)果更接近于電鏡。應用海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡，研究團隊實現(xiàn)了線粒體的超快、超分辨成像，首次在活細胞中解析了線粒體融合、分裂時內(nèi)嵴的活動以及線粒體內(nèi)嵴自身的重組裝過程，并觀察到了活細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體發(fā)生相互作用時的動態(tài)變化。要知道，此前無論是STED還是STORM都無法做到這一點。
也就是說，海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡讓生物學家們觀察到了以前傳統(tǒng)熒光顯微成像技術從未觀察到的新的細胞結(jié)構(gòu)及動態(tài)過程。
分子馬達是一類蛋白質(zhì)，它能將細胞內(nèi)的東西從一個地方轉(zhuǎn)運到另外一個地方。雖然分子馬達的尺寸只有不到100納米，但它卻能以每秒鐘1000納米的速度快速運動，這就使得已有的顯微成像工具無法在活體狀態(tài)下對其進行實時觀察。
但海森結(jié)構(gòu)光顯微成像技術的誕生解決了這個長期以來困擾清華大學生命科學學院教授歐光朔課題組的難題。
“它提供了前所未有的時間和空間分辨率，使我們看到了細胞里面從來沒有看到過的分子馬達運動的一些新的特征和行為。所以，海森結(jié)構(gòu)光顯微成像技術對細胞生物學家來講有著迫切的需求。”歐光朔表示。
佩梅病（PMD）是一種罕見的彌漫性腦白質(zhì)髓鞘形成障礙的X連鎖隱性遺傳疾病，其與兒童的發(fā)育遲緩以及腦白質(zhì)的發(fā)育落后有著密不可分的聯(lián)系。此前通過對致病機制的研究，研究者們一直認為它是由蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)潴積后引發(fā)的，而海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡的出現(xiàn)賦予了研究者們新的研究視角。
“我們應用海森結(jié)構(gòu)光顯微鏡進行了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)方面的研究，發(fā)現(xiàn)了一些新的形式；還發(fā)現(xiàn)佩梅病會伴隨線粒體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)而變化，這是之前所不知道的。這些研究能夠加深我們對神經(jīng)遺傳病的發(fā)生、發(fā)展過程的了解，揭示可能的致病新機制。此外，通過尋找一些藥物新靶點，也有可能開辟篩選特定藥物治療這一類疾病的廣闊前景。”北京大學第一醫(yī)院兒科教授王靜敏表示。
“生命本身是運動的，所以它的運動包含了所有信息。如果我們能看到它在活細胞內(nèi)是怎樣變化的，就有可能知道它在疾病產(chǎn)生時發(fā)生了怎樣的變化以及如何從一個狀態(tài)變到另外一個狀態(tài)。這是我們覺得最有價值的地方。”陳良怡表示�！�