將外源分子注入單細(xì)胞以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)部做力學(xué)研究是細(xì)胞生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一，但是做到這些的前提是將針尖刺入到細(xì)胞內(nèi)部。
然而，大量實(shí)驗(yàn)表明，由磷脂雙分子層構(gòu)成的細(xì)胞膜就像一道神奇的屏障，即便是比頭發(fā)絲細(xì)一千倍的納米針也很難刺入，成功扎透細(xì)胞膜的概率在20%~80%之間，有時(shí)候甚至怎么都扎不進(jìn)去。小小細(xì)胞隱藏著諸多奧秘，細(xì)胞膜究竟具有怎樣的力學(xué)特性實(shí)在令人難以捉摸。
近日，電子科技大學(xué)機(jī)械與電氣工程學(xué)院教授彭倍團(tuán)隊(duì)青年教師范娜博士從細(xì)胞生物力學(xué)的角度，為徹底解開這個(gè)謎團(tuán)帶來了全新的思路，發(fā)現(xiàn)了納米針尖和細(xì)胞膜相互作用時(shí)的刺入機(jī)理，并找到了兩種大幅度提高刺入率的訣竅。
這項(xiàng)研究發(fā)表在國際著名期刊Small上，范娜為論文的第一作者，副教授姜海為共同第一作者，彭倍為論文聯(lián)合通訊作者，電子科技大學(xué)機(jī)械與電氣工程學(xué)院為研究的第一作者單位和通訊作者單位。
發(fā)現(xiàn)科學(xué)問題
刺入活體細(xì)胞，探究生命的奧秘是生命科學(xué)家的夢想。而如何給人體普遍存在的成纖維細(xì)胞注入藥物、蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)錄因子，以誘導(dǎo)這些普通的細(xì)胞變成“萬能”的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，則成為越來越強(qiáng)烈的需求。
“設(shè)想一下，只要取一個(gè)成纖維細(xì)胞，比如普通的皮膚細(xì)胞，就可以誘導(dǎo)產(chǎn)生干細(xì)胞進(jìn)而分化成完全沒有免疫反應(yīng)的全新的眼角膜、全新的皮膚、全新的器官，這將是多么奇妙的事情！”范娜說，“這項(xiàng)技術(shù)一旦成熟，將會(huì)為人類的生命和健康事業(yè)帶來巨大的福祉！”
有了這一技術(shù)，人類研發(fā)和測試新藥就可以摒棄傳統(tǒng)的、飽受倫理詬病的動(dòng)物活體試驗(yàn)，而是通過體外培育特定的人體細(xì)胞組織來進(jìn)行高通量的藥物測試。這樣既可以大大縮短測試新藥的時(shí)間，也可以更加準(zhǔn)確地了解藥物的效用。
然而，細(xì)胞膜的存在給生命科學(xué)家進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部設(shè)置了一道巨大屏障。這層薄膜主要由磷脂雙分子構(gòu)成，雖然厚度僅為8~10納米，但卻具有半透性且富有流動(dòng)性。在針刺方法誕生之前，要想突破這層防線，就得派遣“比針尖還小一萬倍”的“特洛伊木馬”，即讓攜帶轉(zhuǎn)錄因子的病毒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
但是，使用病毒轉(zhuǎn)染的方式存在致癌風(fēng)險(xiǎn)且轉(zhuǎn)染成功的概率僅為1%，尤其是很難區(qū)分哪些細(xì)胞已被轉(zhuǎn)染、哪些細(xì)胞未被轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染程度也無法進(jìn)行精確的量化控制。因此，科學(xué)家逐步探索出了無病毒、非破壞性、可量化控制的新方法，即給細(xì)胞“打針”，直接把藥物、蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)錄因子精準(zhǔn)地注入單個(gè)細(xì)胞內(nèi)部。
范娜在梳理學(xué)界給細(xì)胞“打針”的研究成果時(shí)發(fā)現(xiàn)，納米針要刺入細(xì)胞膜并不容易，刺入效率的范圍低時(shí)可至20%，高時(shí)可達(dá)80%，浮動(dòng)區(qū)間很大。雖然生物學(xué)家已經(jīng)注意到這個(gè)現(xiàn)象，但卻“知其然而不知其所以然”。
因此，她敏銳地意識(shí)到，生物力學(xué)的研究方法或許可以為解釋這個(gè)現(xiàn)象提供新的思路和科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而找到提高刺入率的有效方法，為生物學(xué)家探索細(xì)胞內(nèi)部的奧秘提供理論和技術(shù)支持。
親自動(dòng)手扎針
“紙上得來終覺淺，絕知此事要躬行。”給細(xì)胞“扎針”到底有什么樣的力學(xué)特征？范娜認(rèn)為，要了解這些信息，首先得自己動(dòng)手扎一扎。納米針和成纖維細(xì)胞都很容易購買，在實(shí)驗(yàn)室里完全可以重復(fù)前人的研究。
納米針的學(xué)名叫做原子力顯微鏡探針（AFM tip），其針尖直徑一般為20~100納米，小到肉眼根本無法看見。這種設(shè)備十分靈敏，可以測量到很微小的力——納牛（nN），我們手指輕敲鍵盤的力約為7億納牛。
有了靈敏的納米針，就可以開始給細(xì)胞“打針”了。研究人員先給納米針設(shè)定一個(gè)力值“開關(guān)”，然后從針尖接觸到細(xì)胞膜開始逐漸下壓，加載力也因此逐漸增加。當(dāng)力的大小達(dá)到“開關(guān)”位置時(shí)，納米針就會(huì)立馬彈回來，這個(gè)力就是所謂的“觸發(fā)力”。
在逐漸用力的過程中，如果細(xì)胞膜沒有被刺破，就可以把觸發(fā)力提高一點(diǎn)再刺；如果細(xì)胞膜在某個(gè)力值被刺破了，力的變化曲線就會(huì)記錄下這個(gè)數(shù)值，這個(gè)數(shù)值就是“刺入力”。實(shí)驗(yàn)中，范娜分別對(duì)30個(gè)活細(xì)胞進(jìn)行針刺實(shí)驗(yàn)，每個(gè)細(xì)胞重復(fù)刺4次，一共得到120組數(shù)據(jù)。通過統(tǒng)計(jì)刺入和沒有刺入的力曲線，得到了觸發(fā)力、刺入力與刺入率之間的關(guān)系。
她分別測量了觸發(fā)力為1納牛、3納牛、5納牛、8納牛時(shí)的刺入力，每個(gè)力值得到120組力曲線數(shù)據(jù)。通過分析、統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，她發(fā)現(xiàn)：刺入力遠(yuǎn)低于觸發(fā)力，而且，刺入率與觸發(fā)力也不成正比。
當(dāng)觸發(fā)力為5納牛時(shí)，刺入率達(dá)到最高的15%；再增大觸發(fā)力，刺入力依然在1.3納牛附近徘徊，刺入率反而下降到了12.5%。也就是說，無論加載的力道或大或小，刺入力總是偏向于一個(gè)比較穩(wěn)定的值，不會(huì)隨觸發(fā)力的增加而增加。
按照一般的理解，扎針?biāo)玫牧υ酱螅隙ㄔ饺菀自�。如果畫一條曲線，那么，刺入力肯定是在加載力最大的時(shí)候刺破細(xì)胞膜的。然而，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，這個(gè)“常識(shí)”是不可靠的。
范娜提出了一個(gè)假說：在探針壓入細(xì)胞的過程中，細(xì)胞膜的應(yīng)力不是持續(xù)增加的，可能存在分段的現(xiàn)象，細(xì)胞膜的應(yīng)力達(dá)到一定的數(shù)值就保持不變了，只有這樣才能解釋刺入率不隨外界載荷增加而增加且刺入力遠(yuǎn)小于觸發(fā)力的現(xiàn)象。
探秘細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)
既然把細(xì)胞想象成“皮球”無法解釋實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，那么，細(xì)胞膜的應(yīng)力變化和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)特征肯定還有其他的可能。為了解釋這種可能，范娜在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，建立了細(xì)胞膜“骨架”模型，提出了“細(xì)胞膜應(yīng)力分段效應(yīng)假說”并加以實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
然而，應(yīng)力是“單位面積上的內(nèi)力”，無法直接測量出來。因此，若要驗(yàn)證猜想，需要構(gòu)建合適的數(shù)值模型來準(zhǔn)確計(jì)算。而要構(gòu)建數(shù)值模型，首先得了解細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。
已有研究顯示，細(xì)胞膜下有一層肌動(dòng)蛋白絲，像“柵欄”一樣把細(xì)胞膜分隔成許多隔室。不同類型細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白網(wǎng)格大小各有不同，范圍從30納米到230納米不等。早在1983年就有生物學(xué)家拍下了摩爾比為1：50的肌動(dòng)蛋白/細(xì)絲蛋白網(wǎng)絡(luò)的電子顯微鏡照片。
再加上微管的支撐，細(xì)胞膜就神奇地有了“骨架”。范娜比喻說：“在微管和肌動(dòng)蛋白絲的支撐下，細(xì)胞其實(shí)更像一頂帳篷。”
問題是，這種“骨架”結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞膜應(yīng)力的影響有多大？雖然在2010年已經(jīng)有研究表明，細(xì)胞膜下的肌動(dòng)蛋白絲可能對(duì)能否刺入十分重要，但是該項(xiàng)研究并沒有對(duì)此作出精確的量化描述。
經(jīng)過實(shí)驗(yàn)與有限元分析，范娜證實(shí)，由于細(xì)胞膜骨架具有網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜在針刺過程中的應(yīng)力呈明顯的分段現(xiàn)象（應(yīng)力分段點(diǎn)S）。在應(yīng)力分段點(diǎn)S之前，細(xì)胞膜的應(yīng)力增加很快，之后趨于穩(wěn)定。如果細(xì)胞膜在S點(diǎn)之前不能刺入，就很難再刺入了。因此，要提高穿透率的最好方法，就是提高第一階段細(xì)胞膜的應(yīng)力。
如何提高第一階段細(xì)胞膜的應(yīng)力？原理其實(shí)很簡單，一種方法是增加細(xì)胞膜上的表面張力。研究人員給細(xì)胞表面刷了一層“膠水”——“鼠尾膠原I型蛋白”，這樣就把軟塌塌的細(xì)胞膜繃緊了一些，使其更容易被扎破。另一種方法是減少納米針與細(xì)胞膜之間的接觸面，通俗地說，就是讓針更細(xì)、更尖銳。
實(shí)驗(yàn)顯示，沒有經(jīng)過任何處理的細(xì)胞，刺入力為1.23±0.49納牛，刺入率只有13%；而給細(xì)胞涂上“膠水”之后，刺入力減小到0.86±0.32納牛，刺入率卻提升至39%；如果用更加尖銳的納米針，刺入力可減小到0.58±0.13納牛，刺入率高達(dá)70%。
執(zhí)著的信念
從2015底年開始關(guān)注這一問題，到2018年終于做出成果，范娜與團(tuán)隊(duì)成員用了2年多的時(shí)間終于揭開了給細(xì)胞“扎針”的謎團(tuán)。對(duì)此，論文評(píng)閱人給出了高度評(píng)價(jià)：“這是世界上第一次用細(xì)胞生物力學(xué)方法對(duì)細(xì)胞膜的應(yīng)力給出精確、量化的描述。”
做出這項(xiàng)成果并不容易。2013年，范娜加入電子科大彭倍團(tuán)隊(duì)，雖然此前在讀博期間接觸過生物力學(xué)，但她研究的主要方向還是髖關(guān)節(jié)的摩擦噪聲問題，深入到納米量級(jí)研究生物力學(xué)，對(duì)范娜來說還是第一次。最終，她選擇了一個(gè)生物力學(xué)和納米力學(xué)交叉的切入點(diǎn)——細(xì)胞。
“其實(shí)，我們課題組沒有一個(gè)老師有細(xì)胞研究方面的學(xué)術(shù)背景，更不用說開展這種活體單細(xì)胞研究了。” 范娜說，一切都是從零開始的：從零開始梳理文獻(xiàn)，從零開始學(xué)習(xí)請(qǐng)教，從零開始尋找合作。
沒有納米細(xì)針，就找上海的某研究所加工；不懂細(xì)胞刺入方法，就去重慶大學(xué)生物工程學(xué)院尋求合作。遇到難題或瓶頸，就找彭倍、姜海討論，并發(fā)動(dòng)團(tuán)隊(duì)內(nèi)的博士、碩士一起想辦法，進(jìn)行思想碰撞、頭腦風(fēng)暴。
精準(zhǔn)操控原子力顯微鏡給單個(gè)細(xì)胞“扎針”也是一個(gè)高難度的技術(shù)活。由于納米針很細(xì)、很脆而且價(jià)格不菲，因此，“扎針”時(shí)要求操作很穩(wěn)很準(zhǔn)，否則針頭一旦折斷，買針頭的錢就打水漂了。設(shè)定每一個(gè)觸發(fā)力，都要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)和正式實(shí)驗(yàn)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)下來，范娜給細(xì)胞“扎針”的次數(shù)就達(dá)到了成千上萬次。
由于實(shí)驗(yàn)方案需要和合作單位共同商榷，因此，在做實(shí)驗(yàn)的半年時(shí)間里，范娜經(jīng)常往返于電子科大和重慶大學(xué)。后期的數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)和分析的工作量也非常巨大，團(tuán)隊(duì)的博士生、研究生甚至本科生都積極參與了進(jìn)來。光是論文的撰寫（包括圖片和圖表制作），范娜和姜海就足足修改了32遍。
論文投稿后，他們共收到3位審稿人的反饋意見。其中一位審稿人高度贊揚(yáng)了這項(xiàng)工作；另一位審稿人對(duì)論文寫作的細(xì)節(jié)性問題提出了建議；還有一位審稿人從應(yīng)用前景的角度提出質(zhì)疑，認(rèn)為納米針價(jià)格昂貴，難以推廣應(yīng)用，該項(xiàng)研究意義不大。對(duì)此，范娜毫不膽怯，先后兩次據(jù)理力爭，向?qū)＜谊U述了這項(xiàng)工作的重要意義，并最終說服了專家。2018年5月，論文最終得以在Small上發(fā)表。
“細(xì)胞生物力學(xué)是一個(gè)交叉學(xué)科，可以破解生物學(xué)家以前遇到的許多難題，至少可以提供新的視角和方法，為生命科學(xué)的研究提供有力幫助。”范娜引用“生物力學(xué)之父”馮元楨先生的話與所有的青年學(xué)人共勉：“聽從自己內(nèi)心的聲音，永不放棄對(duì)未知的探索。生命不息，奮斗不止！”■
（作者單位為電子科技大學(xué)）