聚焦循環(huán)系統(tǒng)
腫瘤活檢是醫(yī)學(xué)研究中最麻煩、最危險、最昂貴的一類檢查，研究人員數(shù)十年來一直在努力改進它們。雖然日趨靈敏的檢測方法使醫(yī)生能夠從某些實體腫瘤中提取更小的樣本，但腫瘤學(xué)專家長期以來一直夢想著開發(fā)一種可以完全避免傳統(tǒng)方式的活檢手段。所以科研人員將目光投向了液體活檢，這是一種利用血液或其他容易獲取的體液（如唾液）中的生物標(biāo)記物檢測和分析實體腫瘤的檢測方法。
腫瘤經(jīng)常將細胞和亞細胞成分釋放到血液中，但是通常它們很難被發(fā)現(xiàn)。即使在癌癥晚期，健康細胞和游離生物分子在血液中的濃度仍然比大多數(shù)腫瘤標(biāo)志物高好幾個數(shù)量級。研究人員正在使用新型的純化和分析技術(shù)，將幾類的液體活檢方法推向臨床。
該領(lǐng)域內(nèi)主要有三種檢測手段：檢測游離核酸，分離完整的循環(huán)腫瘤細胞，以及從腫瘤中識別細胞外囊泡。三種方法瑕瑜互見。通過一些已經(jīng)批準(zhǔn)用于臨床的液體活檢和臨床試驗結(jié)果，該領(lǐng)域的專家們一致認(rèn)為，這些方法的應(yīng)用將帶來重大突破。
小反應(yīng)，大作用
在這三種方法中，基于核酸的液體活檢在早期處于核心地位。馬薩諸塞州波士頓丹娜—法伯癌癥研究所(Dana-Farber Cancer Institute)貝爾佛應(yīng)用癌癥研究中心的轉(zhuǎn)化研究實驗室負(fù)責(zé)人Cloud Paweletz認(rèn)為將來基于無細胞的DNA液體活檢方法接受程度和應(yīng)用范圍會變得廣泛，主要是因為它在臨床中的應(yīng)用難度很低，易于掌握。他解釋說，基于DNA的液體活檢通常使用標(biāo)準(zhǔn)的采血管即可，而且基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的活檢對臨床實驗室人員來說特別容易理解，實施起來很容易。
Paweletz和他的同事們正在開發(fā)一種基于PCR的檢測方法，并將其應(yīng)用于肺癌耐藥性突變的檢驗。這項測試在標(biāo)準(zhǔn)血液樣本中進行，僅需要兩天時間，可以識別出影響40%肺癌患者的三種突變中的任何一種。該團隊正在積累臨床活檢經(jīng)驗，以建立腫瘤學(xué)檢測方法。
Geoff Oxnard是波士頓丹娜-法伯癌癥研究所和哈佛醫(yī)學(xué)院的助理教授，也是Paweletz的合作者之一。他評論道：“上周我遇到一個病人，因為轉(zhuǎn)移性肺癌住院，她正是那種可能有上皮生長因子受體EGFR突變的患者，但我無法獲取足夠的組織樣品來進行研究。”Oxnard補充說，通過目前丹娜—法伯癌癥研究所開發(fā)的液體活檢方法，他能夠確定這位患者確實有相應(yīng)的突變，這將使她成為針對該突變的藥物試驗的候選受試者。
Paweletz說：“臨床需要推動這項技術(shù)的發(fā)展，而這項技術(shù)的應(yīng)用也將為臨床診治提供新的能力”。除了基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的檢測，他的團隊還在設(shè)計其他液體活檢方法，如利用二代測序技術(shù)（NGS）來識別更廣泛的腫瘤和突變類型。
對于以PCR為基礎(chǔ)的檢測，包括Paweletz和Oxnard在內(nèi)的許多液體活檢開發(fā)人員發(fā)現(xiàn)，利用常規(guī)的定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）技術(shù)是存在缺陷的。即使在對樣本先進行純化，在待測體液中來自健康細胞的核酸也會多于來自腫瘤的核酸。大量qPCR樣本中的早期偏差將在隨后的周期中被放大，淹沒了腫瘤的信號。加州赫拉克勒斯伯樂（Bio-Rad）的體外診斷部研發(fā)經(jīng)理Dawne Shelton說：“無細胞液體活檢的問題在于，野生型DNA的量可能非常非常高，因此，要避免真正罕見的信號被野生型淹沒……這是關(guān)鍵”。
為了解決這一問題，研究人員采用了一種叫做數(shù)字PCR的技術(shù)，將樣本中的游離DNA分離到只包含單個模板的許多微反應(yīng)中。例如，在Bio-Rad的液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)中，擴增步驟之前，噴霧機將一個樣品分割成成千上萬個納米尺度的微液滴。PCR反應(yīng)發(fā)生在單個液滴內(nèi)部，然后機器利用熒光標(biāo)記的信號進行分選，以檢測目標(biāo)序列。
與NGS相比，數(shù)字PCR相對簡單、價格低廉，對于剛剛開始進行液體活檢技術(shù)研究的人來說，這是一個不二選擇。盡管如此，Shelton警告說，這項技術(shù)需要仔細考慮生物學(xué)家可能很少關(guān)注的問題。她說：“我們所做的大多數(shù)液體活檢都是針對微量的樣品。因此，使用不合適的樣品提取方式或未優(yōu)化的試劑盒可能導(dǎo)致大量信號的遺失。”她補充說，這個微量同時意味著研究人員還必須使用穩(wěn)定的統(tǒng)計學(xué)方法來區(qū)分有意義的腫瘤信號、隨機突變和檢測誤差。
腫瘤釋放的小東西
除了繼續(xù)數(shù)據(jù)分析工作，研究液體活檢的研究人員還需要仔細考慮他們的對照樣品。馬薩諸塞州沃爾瑟姆的賽默飛世爾科技公司臨床測序和腫瘤學(xué)研發(fā)部主任Kelli Bramlett說：“很難讓人造樣本表現(xiàn)得像真正的無細胞核酸一樣，所以這是一個相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。”
Bramlett的團隊致力于人類血液中DNA和RNA的液體活檢技術(shù)的研發(fā)。雖然后者因難以分離而聞名，但她解釋說，即使是已降解的RNA通常也含有足夠完整的序列用來進行分析，只要研究人員能夠在混雜著其他大量RNA分子的環(huán)境中檢測到罕見的腫瘤信號。
極低的信噪比給科學(xué)家和試劑供應(yīng)商帶來了更多挑戰(zhàn)。Bramlett說：“你在干草堆里找這些針，但你經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)很多你并不想找的針，比如產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的微小變化，或者你選用的對照樣品的細微差別。”
大量的質(zhì)量檢測和多樣化的市場需求使得好的商品化試劑和對照樣品都異常昂貴。Bramlett解釋說，生產(chǎn)商首先是致力于提供包含多種對照樣品的復(fù)合產(chǎn)品，以滿足盡可能多種類型的液體活檢需求。 而聚焦于少數(shù)腫瘤標(biāo)志物的研究人員則不得不為那些他們并不需要的對照樣品買單。最近，賽默飛世爾科技公司開始開發(fā)更具針對性的復(fù)合產(chǎn)品，希望可以幫助研究人員進行性價比更高的液體活檢。
然而，在實驗開始之前，實驗室需要為樣本收集和處理擬定合理的流程。Bramlett說：“很多時候，人們都低估了這些步驟的重要性。在你開始研究之前，應(yīng)該把所有這些都考慮進去，確保你有一個好的樣本，可以用于評估你的液體樣品。”
考慮到處理循環(huán)系統(tǒng)游離DNA和RNA片段的難度，許多研究人員在液體活檢中尋找其他東西進行分析也就不足為奇了。這一領(lǐng)域的另外兩個主要目標(biāo)，即循環(huán)腫瘤細胞和外泌體，它們也面臨著各自的挑戰(zhàn)。
Michael Kazinski是位于德國希爾登的凱杰公司（Qiagen）的樣本準(zhǔn)備技術(shù)全球產(chǎn)品管理高級總監(jiān)兼負(fù)責(zé)人，他說：“循環(huán)腫瘤細胞的優(yōu)勢在于它們是完整的活細胞。”從這些細胞中分離出的基因組DNA和RNA使研究人員能夠從液體活檢中獲得完整的轉(zhuǎn)錄譜。這反過來又會幫助我們獲得對腫瘤生物學(xué)的深入了解，至少在理論上是如此。
但研究人員長期以來一直認(rèn)為，腫瘤直到病情較晚時才會將完整的細胞釋放到血液中，而且是以極小的數(shù)量釋放出來。因此，如果想要成功地完成一項檢測，需要分離出足夠的此類稀有細胞，從而對腫瘤做出統(tǒng)計學(xué)上的有效診斷。而這通常是在腫瘤快速生長和變化的階段。最新的研究表明，這些循環(huán)腫瘤細胞可能出現(xiàn)得更早，但要找到它們，仍舊需要極其靈敏的檢驗方法。
第三種方法，同時也是最新的液體活檢方法叫做體外篩選，這種方法依賴于循環(huán)的亞細胞囊泡。Kazinski解釋說這些被稱為“外泌體”的小囊泡實際上是從體內(nèi)的每個活細胞中釋放出來的。 它們具有天然功能，但也可作為RNA的保存容器，除信使RNA外，微泡還含有微小RNA和蛋白質(zhì)，提供有關(guān)其親本細胞的轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)環(huán)境的信息。
不管研究人員采用何種方法， Kazinski都再三強調(diào)謹(jǐn)慎處理樣本的重要性，他說：“被嚴(yán)重低估的是細節(jié)問題的影響：如何抽血，如何儲存甚至運輸它？”凱杰公司推出了一系列經(jīng)過特殊處理的血液采集系統(tǒng)，可對化學(xué)特征穩(wěn)定的樣本進行靈敏的液體活檢。
隨波逐“流”
對于研究循環(huán)腫瘤細胞的人來說，采樣后的下一步是盡可能快速且溫和地分離出所需的細胞。許多腫瘤細胞的表面上有獨特的抗原，而利用親和力技術(shù)可以很容易地將這些細胞從血液樣品中分離出來。事實上，這是在第一個獲得美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的液體活檢試驗CellSearch的基礎(chǔ)上，由強生公司的子公司Veridex開發(fā)的檢測方法。該測試技術(shù)專利現(xiàn)已由加州圣迭戈的Menarini Silicon生物系統(tǒng)公司掌握。
不幸的是，CellSearch也成為了液體活檢開發(fā)人員的一個警示。2008年，美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)了一項測定乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌預(yù)后的試驗。當(dāng)隨后的研究發(fā)現(xiàn)CellSearch的檢測對臨床結(jié)果沒有什么影響時，保險公司就失去了繼續(xù)掏錢的興趣。
盡管許多研究人員仍在開發(fā)基于親和力的技術(shù)來分離循環(huán)腫瘤細胞，但也有一些人正在利用正常細胞和腫瘤細胞之間的物理差異來進行分離研究。加州門羅公園Vortex Biosciences公司的研發(fā)副總裁Elodie Sollier-Christen說：“當(dāng)你走在河邊，會看到河中的漩渦將樹葉和樹枝困住，我們用的是完全相同的流動現(xiàn)象，只是規(guī)模要小得多。”
渦旋系統(tǒng)利用微流控芯片產(chǎn)生微小的渦旋，從血漿樣本中捕獲體積更大、形變更嚴(yán)重的癌細胞。芯片本身是一次性的，系統(tǒng)是完全自動化的。用戶只需從病人身上采集血液樣本，將其輸入設(shè)備，并在幾個小時后取回已經(jīng)純化的腫瘤細胞即可。Sollier-Christen說：“這些細胞沒有被束縛或擠壓，所以它們在流動過程中保持完整，然后研究人員可以把循環(huán)腫瘤細胞拿到他們想要用的各種平臺上進行化驗。”雖然渦旋系統(tǒng)是專門為血液設(shè)計的，但該公司正與學(xué)術(shù)界的研究人員合作，開發(fā)出可以將細胞從其他體液中分離出來的方法，比如腦脊液和尿液。
除了保持細胞的完整性，渦旋系統(tǒng)還使得研究人員能分離出它們，并用來進行單細胞測序或其他分析。這種深入細致的對比分析也說明了至少有些腫瘤釋放細胞的時間比科學(xué)家們認(rèn)為的要早。Sollier-Christen說：“最初的想法是循環(huán)腫瘤細胞只出現(xiàn)在腫瘤晚期。”但是她指出，在過去的一年里，那些高靈敏度技術(shù)檢測到的結(jié)果顯示這些細胞出現(xiàn)在腫瘤發(fā)展的早期，甚至是在腫瘤可以被常規(guī)成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)之前。
面向未來
液體活檢研究的最新趨勢是尋找循環(huán)系統(tǒng)中的細胞外囊泡，這在一定程度上源于研究人員對蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的失望。印第安納州西拉法葉市普渡大學(xué)的生物化學(xué)教授W. Andy Tao說：“我們相信在我們的血液中至少有1萬種蛋白質(zhì)。”毫無疑問，腫瘤為其提供了獨特的蛋白質(zhì)。不幸的是，正常蛋白的高背景，以及循環(huán)磷酸酶和其他降解酶的存在，一直阻礙著研究人員尋找這些罕見的腫瘤生物標(biāo)志物。
為了解決這個問題，Tao博士和他的同事們集中研究了腫瘤釋放出的亞細胞囊泡。由于大多數(shù)腫瘤在發(fā)展過程中的某些階段會表現(xiàn)出磷酸化變化，所以他的實驗室專門研究了囊泡中的蛋白質(zhì)磷酸化。
許多研究者使用免疫學(xué)標(biāo)記從血液中分離細胞外囊泡，Tao喜歡冗長但無偏差的差速離心方法。他的方案是使用逐步提高的離心速度去除血細胞和細胞碎片，然后分離出兩種不同大小的囊泡。
下一個挑戰(zhàn)是鑒定分離出的囊泡中的蛋白質(zhì)，并確定它們的磷酸化狀態(tài)�；诳贵w的測試也可以達到這個目的，但前提是研究人員知道他們正在尋找的蛋白質(zhì)和修飾類型。偏向于更加開放式搜索的研究人員們通常會從患病和健康的病人或動物身上提取樣本，而后使用質(zhì)譜法建立細胞外囊泡相關(guān)蛋白的列表。
盡管最近這些研究顯示新的液體活檢發(fā)展的幾個途徑很有希望，但是Tao警告說，將這些研究結(jié)果向臨床應(yīng)用進行轉(zhuǎn)化仍然需要一系列技術(shù)上的重要改進。“在探索階段，使用差速離心然后進行質(zhì)譜檢測是完全沒問題的，但是當(dāng)你去驗證和檢驗臨床樣品時，我認(rèn)為這肯定不實用。”相反，他計劃縮小有用生物標(biāo)志物的范圍，然后開發(fā)基于抗體的臨床檢驗方法。
不管他們是在尋找游離的DNA、完整的細胞還是細胞外囊泡，研究人員和醫(yī)生都對這個領(lǐng)域的前景表示樂觀。Oxnard預(yù)計，在未來5年里，這將成為一種常規(guī)手段，成為每家醫(yī)院都需要為癌癥患者提供的服務(wù)。■
Alan Dove 是馬薩諸塞州的一位科學(xué)作家和編輯。